我國傳統發酵蔬菜中乳酸菌多樣性的研究進展

葉 陵，李 勇，王蓉蓉，劉成國，蔣立文，鄧放明，周 輝,*

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南省食品科學與生物技術重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.張家界靈潔綠色食品有限公司，湖南 張家界 427000）

2015年，我國的蔬菜種植面積達到2 100余萬hm2，蔬菜產量達到7.69億 t，蔬菜的種植面積與產量均為世界第一。發酵作為蔬菜的一種最簡單和方便的保存方法[1]，自公元前3世紀就已有發酵蔬菜的生產，各種白菜、卷心菜、甜菜、蘿卜、黃瓜、芹菜、青番茄、辣椒、青豆、菜豆等都可用于生產發酵蔬菜。我國是蔬菜生產大國，一年四季均有豐富的蔬菜原料。在我國不同地域，有著豐富多樣的傳統發酵蔬菜，代表性的發酵蔬菜有四川泡菜、榨菜、東北酸菜、湖南剁辣椒、發酵芥菜等（表1），這些發酵蔬菜因其獨特的色、香、味越來越受到廣大消費者的喜愛，已經成為人們日常生活中佐餐的必需品。

表 1 我國主要的傳統發酵蔬菜Table 1 Major traditional fermented vegetables in China

在蔬菜自然發酵過程中，蔬菜表面附著的乳酸菌利用其生成的代謝產物以及形成的低氧環境成為發酵過程中的優勢菌。同時乳酸菌發酵產生的醇、醛、酮和有機酸等物質，賦予了發酵蔬菜柔和的酸味和香氣。因此，發酵蔬菜品質的形成與乳酸菌在發酵過程中的生長代謝作用有著重要的關系。對傳統發酵蔬菜中乳酸菌多樣性的研究，對于開發利用我國傳統發酵食品中蘊含的微生物資源，闡明發酵蔬菜品質的形成機理，進而改進發酵蔬菜的生產工藝有著重要的現實意義。截至目前，國內運用不同的分析手段，對我國不同傳統發酵蔬菜中的乳酸菌多樣性進行了研究。本文對我國代表性傳統發酵蔬菜中乳酸菌多樣性的研究結果進行了總結，指出目前研究過程中所存在的問題，同時對未來的研究方向進行了展望。

1 發酵蔬菜中的乳酸菌多樣性

乳酸菌對于發酵蔬菜的品質形成發揮著多重作用，如增進營養價值、改善食品風味、抑制雜菌生長等。在蔬菜的起始發酵和主發酵階段，占優勢的乳酸菌主要有植物乳桿菌、短乳桿菌、膜狀明串珠菌、戊糖片球菌等[2-3]（表2）。

表 2 我國傳統發酵蔬菜中的乳酸菌Table 2 LAB in traditional fermented vegetables in China

1.1 榨菜

榨菜是中國特產，以其鮮、香、嫩、脆的特點久享盛譽，是世界三大名腌菜之一。榨菜原料青菜頭在植物學上屬十字花科，蕓薹屬，芥菜種莖瘤芥變種，榨菜以其酸鮮純正、脆嫩爽口、解膩開胃、促消化增進食欲而受到消費者的普遍歡迎[30]。榨菜的加工一般要經過修整、脫水、二次鹽腌、淘洗、裝壇后熟發酵等工序，其中腌制工藝的重要環節是后熟過程，該階段是微生物發酵和榨菜風味形成的重要階段。楊珺等[4]采用常規微生物培養方法，對四川榨菜后熟階段微生物區系進行研究，分離得到的乳酸菌主要為植物乳桿菌、發酵乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌等，在整個后熟階段，細菌和酵母數量呈現先上升后穩定的現象，說明乳酸菌和酵母菌的共同作用促成了榨菜香氣的形成。李正國等[5]利用傳統分離培養方法結合基于16S rRNA作為分子標記的變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE），分析了涪陵榨菜腌制過程中不同時期細菌多樣性。兩種方法的研究結果表明優勢菌群是乳桿菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬。利用非培養方法獲得了較多不可培養細菌的信息，但也發現一些嗜冷桿菌出現在榨菜腌制的中后期，可能是腌制加工過程中出現了污染所致。燕平梅等[6]利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE的方法，對榨菜發酵過程中乳酸菌的多樣性進行研究，結果表明榨菜中含有的乳酸菌主要是片球菌屬乳桿菌屬。

目前發酵型榨菜幾乎都采用傳統的自然高鹽腌漬方法，制作工藝粗放，榨菜產品含鹽量高、品質不穩定。翁佩芳等[7]通過構建16S rDNA克隆文庫，對低鹽腌制榨菜中細菌多樣性進行研究，發現乳酸菌主要來自乳桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬，測序結果分析表明存在的乳酸菌菌種多達15 種。結果也發現在不同鹽濃度腌制條件下，起始階段的優勢菌具有一定的差異性，在較高鹽濃度腌制條件下，乳酸菌的種類和數量相對較少。

1.2 大頭菜

大頭菜又稱蕪菁、芥辣、芥菜疙瘩，疙瘩菜是芥菜的一個變種，為根用芥菜，腌制后具有獨特風味。大頭菜在我國有著悠久的種植和加工歷史，早在北魏時期，賈思勰就在《齊民要術》中對大頭菜的腌制方法進行了總結。

目前大頭菜的生產方式大都采用傳統的自然發酵，其缺點是工藝落后、乳酸發酵緩慢、發酵周期長、酸味弱。因此對大頭菜自然發酵過程中功能乳酸菌進行挖掘，應用于大頭菜的接種發酵，成為改進大頭菜生產方式、提高產品品質的重要途徑。近年來對大頭菜自然發酵過程中乳酸菌的多樣性也進行了多項研究，并對分離乳酸菌的發酵性能進行了評價。楊雪等[8]采用常規分離鑒定方法，從自然發酵的大頭菜中分離出植物乳桿菌、耐酸乳桿菌、短乳桿菌，其中植物乳桿菌發酵風味較好，具有較強的產酸能力，具有應用于純種發酵生產大頭菜的潛力。吳希茜[9]同樣采用常規分離鑒定方法，從自然發酵的腌制大頭菜中分離出植物乳桿菌、發酵乳桿菌、乳酸乳桿菌、嗜鹽乳桿菌、乳鏈球菌、腸膜明串珠菌等乳酸菌。將腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌3種菌以3∶1∶1組成發酵劑，接種大頭菜進行純種發酵時，發酵40 d時可實現大頭菜風味、香味、滋味等感官分析指標達到最佳狀態[31]。

1.3 東北酸菜

酸菜是我國東北、內蒙古等地區冬、春季的主要副食品，以其酸鮮純正、脆嫩芳香、清爽可口、回味悠久、增進食欲等特點而深受消費者的喜愛。傳統的東北酸菜以白菜為主要發酵原料，在清洗或速燙殺菌后，用鹽水浸泡在陶缸內，壓緊后在室溫條件下發酵一個月后才食用。與其他傳統發酵蔬菜不同，東北酸菜的腌制鹽質量分數為2%左右，pH 3.1～3.7。

多項研究采用一般傳統分離方法從自然發酵酸菜中鑒定出植物乳桿菌、短乳桿菌、清酒乳桿菌、腸膜明串珠菌等[10-15]。栗永樂等[11]從內蒙古東部地區采集的14 份農家酸菜汁中分離出84 株乳酸菌，除了上述幾種常見的乳酸菌外，還分離出鼠李糖乳桿菌、耐酸乳桿菌、唾液鏈球菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌等，進一步加深了對自然發酵酸菜中乳酸菌多樣性的了解。Miyamoto等[17]從東北酸菜中分離出一株哈爾濱乳桿菌新種，武俊瑞等[13]利用PCR-DGGE技術對東北地區傳統發酵酸菜中的乳酸菌多樣性進行研究，結果表明植物乳桿菌、短乳桿菌、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌是酸菜中的優勢菌群，此外還首次發現了哈米斯乳桿菌和臭味乳桿菌。另外，有多項研究利用PCR-DGGE技術研究了酸菜中乳酸菌多樣性，結果表明除了優勢菌與上述武俊瑞等的研究結果相同外，還鑒定出棒狀乳桿菌、戊糖乳桿菌、唾液乳桿菌、巖川乳桿菌等傳統分離方法未分離鑒定的菌種[14,32]。有研究表明彎曲乳桿菌是酸菜發酵的主要乳酸菌，該菌的生長速率快于腸膜明串珠菌，因此能成為酸菜發酵的優勢菌[33]。

李超[18]通過構建克隆文庫的方法對酸菜發酵過程中的微生物動態變化進行解析，乳酸菌的檢測結果表明酸菜自然發酵分為同型發酵和異型發酵兩個階段，發酵前期以異型發酵為主，而后期則以同型發酵為主，結果首次表明oligofermentans乳桿菌參與了酸菜的發酵過程。隨后采用傳統分離方法對不同發酵時期的酸菜中乳酸菌進行分離，結果表明酸菜發酵6 d時，分離的菌屬主要是明串珠菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬等異型發酵乳酸菌。而酸菜發酵26 d時分離的乳酸菌主要是植物乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌等。采用同型發酵乳酸菌彎曲乳桿菌和異型發酵乳酸菌腸膜明串珠菌進行酸菜的純種發酵，結果表明接種發酵可有效降低酸菜中的亞硝酸鹽含量，明顯增加乳酸的含量。

1.4 發酵辣椒

我國是辣椒最大的生產國，辣椒的初加工主要有干制、腌制、油制、泡漬等。其中腌制辣椒就包括剁辣椒、泡辣椒、辣椒醬等發酵辣椒產品。自然發酵法制成的發酵辣椒產品主要是利用其天然辣椒表面附著的乳酸菌進行發酵，經過乳酸發酵以后，其味酸辣、可口，并且具有開胃的功能。

剁辣椒是湖南最常見的發酵辣椒產品，其傳統加工方法是利用乳酸菌的自然發酵和食鹽保存作用對辣椒進行加工處理，目前剁辣椒加工企業普遍采用超過食鹽質量分數20%以上的高鹽腌制辣椒的方法進行加工，這樣雖然可保留辣椒的色澤、辣味和脆度，但是產品沒有發酵辣椒特有的風味和香氣，而且加工食用前要經過脫鹽處理，這樣增加了生產成本，同時也造成了環境的污染。因此，選用發酵性能優良的乳酸菌進行辣椒的接種發酵，成為提高發酵辣椒品質的重要途徑。

趙玲艷等[21]從自然發酵辣椒中分離出3 株產酸快、耐鹽能力強的乳桿菌，具有應用于辣椒純種發酵的潛力。鐘燕青[22]、王蘭[23]、王麗芳[24]等先后從自然發酵辣椒中分離出植物乳桿菌和戊糖片球菌，幾株分離菌株都顯示了極強的產酸能力。王修俊等[25]從自然發酵辣椒汁中分離出一株植物乳桿菌，具有較強的耐鹽和產酸能力，適用于發酵辣椒的生產。

1.5 泡菜

我國泡菜歷史悠久，是一種傳統的發酵食品[34]，其中以四川泡菜最為著名，四川適宜的氣候條件以及豐富的蔬菜資源，使得四川泡菜品種繁多。

盛海圓[26]對市售及自制泡菜中乳酸菌進行了分離和鑒定，分離鑒定出植物乳桿菌、耐久腸球菌、布氏乳桿菌、香腸乳桿菌、消化乳桿菌、短乳桿菌、戊糖片球菌等。結果證實不同樣品之間乳酸菌種類存在一定的差異性，但兩種不同來源的泡菜中，植物乳桿菌是主要的優勢菌。周光燕[27]采集了四川地區自然發酵泡菜34 份，從中共分離出116 株乳酸菌，其中乳桿菌94 株，球菌22 株。乳桿菌主要是干酪乳桿菌干酪亞種、棒狀乳桿菌棒狀亞種、植物乳桿菌等，還分離鑒定出并不常見的玉米乳桿菌、綠色乳桿菌、草乳桿菌、類布氏乳桿菌等乳桿菌，說明四川地區的泡菜中微生物種類非常豐富。陳功等[28]以傳統優質四川泡菜為研究對象，初步研究了不同區域優勢微生物的菌群和生態分布，初步確定了四川泡菜中的乳酸菌主要是植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌、耐乙醇片球菌等。張蓓蓓等[29]從180余份的泡菜中分離出447 株乳酸菌，共鑒定出11 個屬34 個種，確定了腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌等乳桿菌為主要優勢菌群，研究結果為四川泡菜微生物資源的標準化整理整合提供了參考。杜曉華等[35]從泡菜中分離得到一株酶降解亞硝酸鹽的植物乳桿菌，將該菌株接種至發酵泡菜，可快速降低泡菜中的亞硝酸鹽含量。

基于泡菜中含有豐富的乳酸菌，有研究學者從泡菜中篩選具有特殊生理功能的乳酸菌。Yu Zhihui等[36]從自然發酵泡菜中分離出一株有耐膽鹽、耐酸等益生特性的植物乳桿菌，該植物乳桿菌發酵的酸奶可明顯降低小鼠血清中的膽固醇含量，提示其可作為潛在的具有降血脂功能的益生菌。Li Ming等[37]通過肌酐和鳥苷體外降解、耐膽鹽、拮抗、細胞黏附等實驗，篩選到一株具有降低尿酸的植物乳桿菌，體內實驗也證實了灌胃該植物乳桿菌菌液可以降低高尿酸大鼠血清中的尿酸含量。Liu Pei等[38]從自然發酵泡菜中分離出一株高產共軛亞油酸的植物乳桿菌，在48 h內可實現亞油酸26.1%的轉化，因此該菌株具有作為可提高泡菜共軛亞油酸含量的發酵劑的潛力。Luo Wei等[39]從泡菜中分離出對沙門氏菌具有拮抗作用的植物乳桿菌和短乳桿菌，保鮮實驗證實了乳桿菌培養液對鮮切蘋果表面的沙門氏菌具有較強的抑制作用，可延緩鮮切蘋果的腐敗。Yang Zhennai等[40]從自然發酵泡菜中分離出一株產胞外多糖的鼠李糖乳桿菌，所產多糖主要由半乳糖和N-乙酰葡糖胺構成，利用該鼠李糖乳桿菌發酵可提高酸乳持水力，改善發酵乳的流變特性。

1.6 其他發酵蔬菜

葉用芥菜是我國傳統的地方性腌制食品，具有香氣濃郁、風味鮮美、組織嫩脆的特點，用于佐食可以增進食欲，因而深受廣大消費者的喜愛。林親錄等[41]從湖南省華容縣地窖傳統發酵芥菜中分離得到兩株乳桿菌，將其進行接種發酵實驗時，可明顯縮短芥菜發酵時間，產品中亞硝酸鹽含量明顯低于自然發酵。顧振宇等[42]通過對芥菜半干腌制發酵過程中的乳酸菌進行分離，共鑒定出腸膜明串珠菌、發酵乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸片球菌、短乳桿菌等乳酸菌，此外還鑒定出酵母菌，說明芥菜發酵是一個多菌種共同參與的過程。王一淇等[43]的研究結果表明，在芥菜發酵前期，優勢乳酸菌為乳酸球菌，隨著乳酸的不斷產生，乳球菌由于不耐酸，其生長受到抑制，而乳桿菌的生長則加快，并超過乳酸球菌的數量，在發酵中后期，乳桿菌成為主要的優勢乳酸菌。

酸豆角是原料豆角經過腌制處理并在腌制過程中進行乳酸發酵的發酵產品，黃誠等[44]利用常規分離方法從湘西傳統發酵酸豆角中分離出短乳桿菌、腸膜明串珠菌，分離菌株耐鹽能力強，產酸快。劉銳等[45]也從自然發酵豆角中分離得到一株明串珠菌，其代謝產物具有明顯的抑菌作用。

2 乳酸菌多樣性研究中存在的問題

2.1 多樣性研究技術方法單一

從目前我國對傳統發酵蔬菜中乳酸菌多樣性研究的現狀來看，絕大多數研究所采用的分離方法完全依靠傳統的分離培養，分離出的乳酸菌種類和數量少，很多種乳酸菌無法檢測出。而依靠先進的微生物非培養技術，如PCR-DGGE技術，可對傳統發酵蔬菜中大量無法培養的微生物進行檢測，不但方法成熟簡便，而且可檢測出大量常規分離培養方法無法分離的菌株，從而加深對傳統發酵蔬菜中微生物菌群的了解，有利于進一步闡明傳統發酵蔬菜品質形成的機制。

值得注意的是，在一些研究中，分子鑒定方法與傳統培養方法中生物菌群存在一定的差異，得到的優勢菌不同，往往用分子生物學方法獲得的相對豐度高的優勢菌多是不可培養的細菌，而傳統方法獲得的總菌落數比例最高的優勢菌在分子生物學檢測中大多是低豐度細菌，這可能是方法本身的局限性所致，如樣品的DNA提取效率電泳的條件影響等。因此，未來在進行微生物多樣性分析時，應注意對不同方法的結果進行比較，合理進行方法的選擇及補充。

2.2 乳酸菌分離篩選的樣品量少

目前的研究結果表明我國的傳統發酵蔬菜中乳酸菌的種類非常豐富，然而多數的研究報道結果均來自于對單一發酵蔬菜樣品中乳酸菌的分離鑒定，從中分離鑒定出的乳酸菌具有很大的偶然性，因此研究結果并不能完全代表此種發酵蔬菜中乳酸菌菌群的整體面貌，如我國各地常見的自然發酵泡菜，其中的原料有豇豆、青菜、蘿卜、白菜等，在進行微生物多樣性的研究時，應考慮原料的組成，分析不同原料對研究結果的影響。為全面了解發酵蔬菜中乳酸菌的種類和分布，應該首先考慮廣泛收集傳統發酵蔬菜制作地區的樣品，在具備充足樣品量的基礎上，結合常規的分離技術和分子生物學技術進行乳酸菌的分離鑒定，這樣得到的結果才具有代表性。

2.3 乳酸菌在發酵蔬菜風味形成中作用機制的研究缺乏

從目前對我國不同傳統發酵蔬菜中乳酸菌多樣性研究的現狀來看，不同地域具有不同的代表性發酵蔬菜，其中植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌等是植物源蔬菜中常見的乳酸菌。雖然了解了自然發酵蔬菜中常見的乳酸菌，但對于這些乳酸菌在發酵蔬菜風味形成中的機制研究比較少。已發現在四川榨菜和泡菜發酵過程中，有乳酸菌和酵母菌的共同參與[46]；但乳酸菌與其他種類微生物是何種關系，作為優勢菌群，乳酸菌的代謝物如何和酵母菌代謝物相互作用，從而形成泡菜的風味物質等仍然不清楚。

3 結 語

從目前對乳酸菌多樣性已有的研究結果可知，傳統發酵蔬菜中蘊含著豐富的乳酸菌資源，未來的研究可從兩方面進行。

加強對乳酸菌在發酵蔬菜品質形成中作用機制的研究。研究乳酸菌在傳統發酵蔬菜品質形成中作用機理時，可采用乳酸菌單獨發酵或乳酸菌酵母菌混合發酵的形式；利用氣相色譜-質譜、電子鼻等先進風味檢測技術，對接種發酵蔬菜的風味進行研究；利用代謝組學技術手段分析發酵過程中代謝物的變化規律；利用主成分分析等聚類分析方法分析出接種發酵所產生的關鍵物質，闡明乳酸菌在傳統發酵蔬菜品質形成中的作用機理，為進一步開發利用乳酸菌作為蔬菜發酵劑提供依據。

加強對傳統發酵蔬菜中益生菌的篩選及應用研究。我國傳統發酵蔬菜品種繁多，其中蘊含著豐富多樣的乳酸菌，可為益生菌的篩選提供強大的菌種庫。在對發酵蔬菜中乳酸菌進行開發利用的同時，不可忽視乳酸菌的安全性問題，如乳酸菌的耐藥性、產生物胺等問題，已有研究報道指出泡菜原料表面多種乳酸菌對抗生素存在一定的抗性[47-48]，但是否存在耐藥質粒產生可轉移性、其他發酵蔬菜中乳酸菌的耐藥性如何，還需要進一步的研究。因此，未來對發酵蔬菜中乳酸菌的開發利用，需要將乳酸菌的發酵特性、益生特性與安全性并舉，以作為篩選的重要原則。