乳酸菌抗氧化調控體系研究進展

楊明陽，田建軍，景智波，趙麗華，張開屏，靳 燁,*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古商貿職業學院食品工程系，內蒙古 呼和浩特 010070）

機體發生氧化反應時會產生自由基，正常情況下自由基的產生和清除處于動態平衡，而外界條件會破壞平衡導致機體出現氧化應激，機體內的生物大分子被破壞、組織器官的功能下降、老化速度加快，進而引發一系列疾病包括癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病和關節炎等[1]。因此，自由基與疾病的關系受到越來越多的關注，而尋找和開發天然無毒的抗氧化劑也成為各個領域的研究熱點，預計到2018年，抗氧化劑的市場價值將以4.5%的年增長率增長至2.385億 美元[2]。研究表明，乳酸菌具有提高機體免疫力、防止人體衰老、維持腸道菌群平衡、抗癌、降糖和降脂等生理功能，并且其在多種體內外實驗中均已被證實有較好的抗氧化活性[3-4]。乳酸菌被認為是天然抗氧化劑的主要來源之一，其抗氧化作用成為各個領域學者研究的熱點，乳酸菌抗氧化特性的深入研究對新型功能性食品生產和藥品研發具有重大的意義。為了更加全面地了解乳酸菌，對乳酸菌作用機制的研究迫在眉睫。

1 乳酸菌抗氧化作用調控體系

乳酸菌是一類革蘭氏陽性、過氧化氫酶（catalase，CAT）陰性、無芽孢細菌的總稱[5]，巴斯德于1857年首次發現乳酸菌，俄國病理學家Metchnikoff于1908年在乳酸菌發酵酸奶中發現乳酸菌的抗氧化作用[6]。研究發現，乳酸菌具有明顯的抗氧化作用，其抗氧化作用的本質是清除自由基、螯合金屬離子、提高抗氧化酶活力等[7]。目前對于乳酸菌抗氧化作用特性的研究還沒有明確結論，就當前而言，乳酸菌的抗氧化機制主要為如下幾種（圖1），而乳酸菌的各種調控機制不是單一作用而是相互關聯的[8]。

圖 1 乳酸菌抗氧化作用調控體系[8]Fig. 1 Regulation system of antioxidant activity of lactic acid bacteria[8]

1.1 氧化還原調控系統

乳酸菌氧化還原調控系統較多，其中最主要的是Trx系統、GSH系統和“NADH氧化酶/NADH過氧化酶”系統，電子轉移程度對氧化還原系統的作用具有重要影響。

Trx系統由Trx、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）和還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）組成，細胞質中的Trx系統如圖2所示[9]。Trx是分子質量為12 kDa左右的多肽，調節氧化還原反應的位點是Cys-Gly-Pro-Cys[10]。Trx系統能維持干酪乳酸菌細胞內巰基/二硫鍵平衡，Trx通過調控細胞凋亡信號調節激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）促進MAPKs的表達或調控核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）通路等抑制細胞衰亡，參與氧化還原反應[11]。

GSH系統主要是由GSH、GPx、谷胱甘肽還原酶（glutathi-one reductase，GR）以及谷胱甘肽轉硫酶（glutathi-one-S-transferase，GST）組成，能直接清除機體自由基，防止細胞損傷[12]。GSH是一種非蛋白肽（Glu-Cys-Gly），通過上調抗凋亡基因B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、下調促凋亡基因Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表達，清除機體內自由基，調節凋亡基因Bcl-2與Bax的比值，發揮抗氧化作用，決定細胞的存在狀態。GSH系統中最重要的抗氧化酶是GPx，研究表明，它的缺失會使體內H2O2含量上升，脂質過氧化物含量增多[13]。給自發性高血壓小鼠灌胃干酪乳桿菌8 周后，發現小鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量明顯下降，GSH含量明顯升高，說明干酪乳桿菌能夠調控谷胱甘肽系統，改善高血壓[14]。GSH系統和Trx系統多數情況下是平行工作的，然而越來越多的研究表明，Trx系統可能誘導GSH系統的抗氧化表達發揮抗氧化作用，當Trx的TrxR的電子傳遞途徑受阻時，GSH系統可以作為一個備份系統，如圖2所示。

圖 2 細胞質中的Trx和GSH系統[9]Fig. 2 Trx and GSH systems in the cytosol[9]

GSH和Trx是哺乳動物體內兩種主要的巰基依賴性的抗氧化系統。如圖2所示，Trx系統通過TrxR催化NADPH氧化酶供氫，將氧化型Trx轉化為還原型，向Prx提供電子。還原型Trx調節許多氧化敏感的轉錄因子如NF-κB、Nrf2與ASK1等參與氧化還原反應，當Trx從TrxR的電子傳遞途徑受阻時，GR會以NADPH作為電子供體，將氧化型GSH還原為GSH，GSH能激活GPx活性達到清除脂質過氧化物和H2O2的目的。同時GSH能在體外將氧化型Trx還原，作為TrxR的備份，為Trx提供電子。

乳酸菌中的NADH氧化酶產生H2O2，促使NADH過氧化酶清除H2O2，防止細胞損傷。研究發現，嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌在0%、5%、10%、15%和21%的氧氣中相互作用，通過NADH氧化酶/NADH過氧化酶系統抵抗氧脅迫[15]。

1.2 調控信號通路

研究表明乳酸菌能夠調控與氧化應激相關的信號通路以緩解氧化損傷。目前，乳酸菌的主要調控通路是Nrf2/ARE，它能調節機體超過1%的基因，正常狀態下，含蛋白E3泛素連接酶（cubiquitin protein ligase E3，CUL3-E3）的Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）偶聯被鎖定在細胞質中，當發生氧化應激時通過作用于特異性半胱氨酸殘基Keap1引起Keap1-CUL3-E3泛素連接酶的構象變化，Nrf2與Keap1分離，并快速移動到細胞核中，與ARE結合，誘導抗氧化酶/蛋白如GST、奎寧氧化還原酶（nicotinamide quinone oxidoreductase 1，NQO1）、血紅素加氧酶（heme oxygenase-1，HO-1）和SOD、Trx、p53等的表達，以此緩解氧化損傷[16]。Gao Dawei等[17]發現服用植物乳桿菌FC225能明顯提高高血脂小鼠SOD和GPx活力，提高肝細胞核中Nrf2表達量，植物乳桿菌FC225能夠通過調控Nrf2/ARE通路發揮抗氧化作用。Yang Xin等[18]利用植物乳桿菌JM113飼喂雛雞，發現雛雞腸黏膜內MDA含量顯著降低，同時激活Nrf2信號通路，誘導其下游調控氧化應激的基因H0-1 mRNA的表達，說明分離自藏雞腸道內的植物乳桿菌JM113能調控Nrf2/ARE通路，誘導其下游抗氧化基因的表達。抗氧化酶通過氧化還原反應將自由基轉化為安全無毒的物質，或通過增強自身水溶性促進自由基排除。乳酸菌能夠通過提高抗氧化酶活力防止機體受到損傷。這些酶類物質自由基代謝途徑在不同部位發揮著協同作用，如CAT和GPx會將SOD清除超氧陰離子自由基形成的過氧化氫（H2O2）分解成水和氧氣，從而防止羥自由基（·OH）的形成[19]。抗氧化酶活力的高低間接反映菌體清除自由基的能力，而MDA作為脂質過氧化的產物，其含量又間接反映自由基損傷機體的嚴重程度，因此抗氧化酶活力和MDA含量通常是同時測定的[20]。Wang Ying等[21]在新疆駝乳酸奶中經過體外實驗篩選出1 株具有較強抗氧化活性的干酪乳桿菌FM-LP4，經過D-半乳糖誘導氧化損傷小鼠實驗，發現FM-LP4能顯著降低小鼠血清中內的毒素水平，這與其能夠提高SOD、GPx的活力、抑制MDA的形成有密不可分的關系。

激活Nrf2/ARE通路需要3 步：1）擁有Nrf2穩定蛋白；2）Nrf2蛋白質轉運到細胞核；3）Nrf2蛋白轉錄激活Nrf2靶基因。因此，可以用Nrf2靶基因的相對表達衡量Nrf2通路被活化的程度[22]。Nrf2/ARE通路的活化是由多種信號分子誘導的，Keap1使Nrf2阻遏蛋白在非脅迫條件下保持Nrf2活性，在發生氧化脅迫時調控Nrf2/ARE信號通路的激酶為：蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）促進Nrf2磷酸化，激活Nrf2/ARE信號通路；磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B作為細胞生長、增殖和細胞存活的關鍵信號軸也參與激活Nrf2/ARE信號通路；另外，MAPKs信號通路包括細胞外調節激酶ERK（extracellular signal-regulated kinase）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N terminal kinase，JNK）和p38 MAPKs，它們也是調節Nrf2信號通路的機制之一[23]。與其他激酶對Nrf2/ARE的調控相比，JNK發揮著較為主要作用，乳酸菌可能是通過誘導ASK激酶家族的表達激活JNK。Kobatake等[24]發現加氏乳桿菌SBT2055通過激活JNK信號促使Nrf2蛋白水平增加，然后上調其靶基因Sod1-3、Trx1、Hmox1和NQO1等的mRNA表達，增強抗氧化應激防御系統。

1.3 清除ROS和自由基

自由基主要在線粒體內產生，釋放到細胞質中。乳酸菌會在自由基與機體內的大分子發生鏈式反應損傷細胞之前將自由基清除。機體中形成的自由基包括超氧陰離子自由基（O2－?）、H2O2、·OH、單線態氧（1O2）、氫過氧化物自由基（HOO·）等。1O2和H2O2通過Fenton反應生成活性最強的·OH，乳酸菌清除·OH的能力最強。另外，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基通過形成化合物，快速、直接地反映乳酸菌的抗氧化能力，是體外實驗中常用的一個測定指標。Suo Huayi等[25]以清除DPPH自由基和·OH能力為指標來評價乳酸菌Zhao的抗氧化能力；Hashemi等[26]在研究酸奶的氧化穩定性時發現植物乳桿菌LS5的DPPH自由基清除率可以達到49.6%。

1.4 螯合金屬離子

過量金屬離子將氫過氧化物分解形成H2O2和烷氧自由基，使機體出現氧化損傷。金屬離子會參與Fenton反應，生成引起脂質過氧化和DNA損傷的·OH。乳酸菌通過螯合金屬離子，能夠防止生成ROS，減少脂質發生氧化和DNA損傷的概率。Lee等[27]研究發現干酪乳桿菌KCTC 3260的完整細胞和無細胞提取物抑制脂質過氧化率分別為46.2%和72.9%，在其中并未檢測到SOD，但螯合F e2+和C u2+的能力分別為1.0 6×1 0?5m g/L和2.18×10?5mg/L，說明干酪乳桿菌KCTC 3260抗氧化能力可能是通過螯合金屬離子引起的，而不是通過提高SOD活力。Su Jing等[28]認為酒明串珠菌（Leuconostoc oenos）能夠應對惡劣環境的原因之一是它能夠螯合Fe2+。

1.5 產生抗氧化分子

乳酸菌被食用后會停留在腸道一定時間，通過代謝反應向細胞壁外分泌一些代謝產物如胞外多糖和生物活性肽，這些物質會發揮抗氧化作用，抑制脂質自由基連鎖反應的發生[29]。胞外多糖是乳酸菌在代謝過程中產生的一種附著在細菌表面與細胞結合的多糖，或分泌到細胞壁外的黏液或莢膜多糖，由葡萄糖、甘露糖和半乳糖通過不同的配比組成，胞外多糖的抗氧化活性主要與其高級結構有關，具有一定空間結構的胞外多糖抗氧化作用更強[30]。抗氧化肽的活性取決于特定的氨基酸序列，通過以下途徑發揮作用：2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基清除劑的作用；抑制ROS生成；抑制炎性細胞因子的釋放，如腫瘤壞死因子α（tumour necrosises factor α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）[31]。另外，乳酸菌代謝中間產物也具有抗氧化作用，Furumoto等[32]發現腸道植物乳桿菌產生的亞油酸代謝衍生物長鏈脂肪酸KetoC由于具有α、β不飽和羰基基團，能夠激活Nrf2通路并誘導抗氧化基因的表達，保護H2O2誘導的肝癌細胞HepG2免受細胞毒性的損傷。

2 乳酸菌抗氧化作用新的模型評價體系

乳酸菌抗氧化能力的判定主要是對菌體完整的細胞、發酵上清液和無細胞提取物進行研究，以螯合金屬離子、清除自由基、抑制脂質過氧化、耐H2O2能力、抑制亞油酸過氧化和還原能力等為測定指標。Xu Shuang等[33]為了評估分離自中國傳統發酵食品中乳酸菌的抗氧化活性，對菌株完整細胞和無細胞提取物清除·OH、螯合Fe2+的能力以及還原能力進行了測定。隨著技術的發展和研究需求，幾種新的方法被用于乳酸菌抗氧化能力的評定。

2.1 細胞模型評價體系

建立細胞模型是近年來發展起來的新的體外評價體系，直接以細胞為載體，未脫離機體本身，能更真實地反映氧化還原反應，在實際應用中可以直接檢測到菌株的抗氧化能力，為乳酸菌抗氧化機制的研究奠定一定基礎。Kuda等[34]為了研究分離自壽司的腸膜明串珠菌的抗氧化活性，構建了對小鼠巨噬細胞RAW264.7抗炎作用的模型，研究結果表明腸膜明串珠菌1R3M能夠抑制大腸桿菌脂多糖產生NO、緩解結腸炎和腹瀉，腸膜明串珠菌可以作為改善炎癥的益生菌。Xing Jiali等[35]分別用清除DPPH自由基和建立細胞模型的方法評價了10 株乳酸桿菌的抗氧化能力，并對兩種方法進行比較，結果發現，細胞模型是一種能夠更好檢測乳酸菌抗氧化活性的方法。Yu Xiaomin等[36]發現黏膜乳桿菌和植物乳桿菌能上調人結腸癌細胞HT-29和人克隆結腸腺癌細胞Caco-2中主抗氧化基因MT1、MT2等的表達，并提高抗氧化酶SOD、GPx等的活力。

2.2 動物模型評價體系

體外實驗只能通過模擬機體內部的環境對乳酸菌的抗氧化特性進行初步評價，不能確定其在機體內部其是否能夠同樣發揮作用，因此需要建立動物模型測定血液或器官中的指標來驗證乳酸菌緩解氧化應激的能力，如測定酶類抗氧化物質的變化、抗脂質水平以及MDA含量的變化[37]。Yadav等[38]將乳酸菌發酵食品低脂酸奶Dahi飼喂給高果糖誘導的糖尿病小鼠，記錄在這一過程中肝臟和胰腺組織中氧化狀態的硫代巴比妥酸和GSH的含量，結果顯示氧化狀態的硫代巴比妥酸含量降低，而GSH的含量明顯升高，說明Dahi能改善大鼠的氧化應激水平。朱光華[39]發現干酪乳桿菌N2和植物乳桿菌X9能夠提高高脂血癥小鼠肝和腎組織中SOD和GPx的活力，降低MDA含量，并誘導抗氧化基因Nrf2的表達。Kumar等[40]用含有發酵乳桿菌RS-2的牛奶喂養糖尿病小鼠，發現小鼠肝臟和血液的血糖水平和脂質參數都有所下降，說明益生菌能緩解糖尿病的嚴重程度。

2.3 臨床實驗評價體系

人與動物的身體機能存在一定的差異性，要想確定基于體內外實驗篩選的具有抗氧化能力的乳酸菌能否調節人體的氧化應激，需要通過臨床實驗對乳酸菌發酵制品進行驗證，而臨床實驗可行性差且相對復雜，導致目前對于在臨床上的研究主要集中在幾株乳酸菌上，如乳酸雙歧桿菌Bb12、干酪乳桿菌01等。發酵乳桿菌ME-3能降低血漿中氧化低密度脂蛋白，提高人體的總抗氧化能力，抑制動脈粥樣硬化的產生[41]。Ejtahed等[42]將64 例II型糖尿病病人分為兩組，干預組患者每天服用含有嗜酸乳桿菌LA5和雙歧桿菌Bb12的益生菌酸奶300 g，而對照組每天服用300 g的常規酸奶，6 周之后，干預組患者紅細胞中SOD和GPx活力增強，血清中MDA含量降低，總抗氧化能力增強。Asemi等[43]研究了益生菌酸奶對孕婦氧化應激水平的影響，70 名孕婦隨機分為兩組，以傳統酸奶為對照，結果發現益生菌酸奶明顯提高了紅細胞GR水平，但對血漿GSH、紅細胞GPx等其他氧化應激指標沒有顯著影響。然而Vaghef-Mehrabany等[44]卻有不同發現，他們將46 例類風濕關節炎患者分為兩組，益生菌組每天服用含有干酪乳桿菌01膠囊，對照組每天服用相同劑量麥芽糊精膠囊，8 周之后，對MDA含量、SOD、CAT活力等指標進行評估，發現各項指標沒有顯著性差異，說明益生菌不會影響人體健康。在未來的臨床實驗中，可以考慮采取較長時間的治療，并調查不同劑量和不同種類的益生微生物對人體的影響。雖然在現有的一些實驗中乳酸菌對于人體具有一定的抗氧化效果，但隨著菌株種類、劑量以及作用時間的改變，還需要進行更深層次的研究。

3 抗氧化乳酸菌應用現狀

乳酸菌經常在各種食品中被發現，包括肉、蔬菜、水果、乳制品，在呼吸道、腸道、污水、人類和動物生殖道以及植物原材料中也有存在，抗氧化活性乳酸菌能夠通過發酵產品提高產品的風味、質地和貨架期等，同時可以利用乳酸菌的生理功能，生產益生制品如抗氧化膠囊和片劑、保健品以及藥品等。

Geeta等[45]利用植物乳桿菌對加入葡萄糖和淀粉的雞肉進行發酵，發現其對·OH、O2－?、DPPH自由基清除能力增強，理化特性相對較好，脂質過氧化程度、微生物含量上有所降低。Zhao Huimin等[46]利用酵母菌和乳酸菌對小麥麩皮進行固態發酵，發現水溶性阿拉伯木聚糖含量比原料麩皮提高了3～4 倍，總膳食纖維和可溶性膳食纖維含量有所增加，超過20%的植酸被降解，抗氧化活性有所提高。Huang Li等[22]利用分離自內蒙古傳統發酵豆腐的植物乳桿菌C88調控Nrf2/ARE通路，發現其能上調谷胱甘肽硫轉移酶的表達以緩解氧化應激，同時下調細胞色素基因P4501A2和CYP3A4以防止黃曲霉毒素的形成。Ojekunle等[47]在進行利用分離自尼日利亞傳統食品中的植物乳桿菌緩解重金屬毒性研究時發現，服用植物乳桿菌的實驗組能抵抗鉛和鉻對小鼠造成的腎和肝功能損傷。木薯發酵食品是巴西土著人的傳統制品，Freire等[48]的實驗首次以木薯和大米為原料，使用植物乳桿菌和酵母對其進行發酵，生產非乳制發酵飲料，發現其礦物質含量豐富、感官性能良好，產品的消化率有所提高。單闖[49]用瑞士乳桿菌發酵液（NS8-fermented milk supernatant，NS-FS）延緩皮膚光衰老，發現NS-FS能提高紫外線誘導損傷小鼠的抗氧化酶水平，誘導Nrf2蛋白表達，對紫外線致皮膚衰老有干預作用。Dawood等[50]利用鼠李糖乳桿菌、乳酸乳球菌或者兩種菌的混合物制品飼喂給真鯛苗種56 d后，發現與使用單一菌株相比，使用兩者的混合物能夠顯著提高血漿總蛋白含量、Prx和SOD的活力，降低總膽固醇和甘油三酯的含量，說明兩者的混合物能夠有效提高真鯛的免疫力和抗氧化活性。

4 結 語

我國乳酸菌菌種資源豐富，為開發天然抗氧化劑提供了有利條件。乳酸菌的抗氧化活性自20世紀90年代被發現以來，一直是各個領域學者研究的熱點。乳酸菌可以通過清除自由基、提高抗氧化酶的活力、降低MDA含量、調控相關信號通路等發揮抗氧化作用，通過對乳酸菌抗氧化調控體系的研究，簡化抗氧化乳酸菌的篩選過程，有助于功能性食品和新型藥品的開發，為相關疾病的治療提供了新思路。然而其抗氧化機制依然沒有有效地建立起來，這將是未來幾年抗氧化乳酸菌研究的熱點。在評價體系方面，細胞代謝組學與使用動物血清、組織或體液來評價抗氧化活性相比方便快捷、可控性強，與細胞學評價方法相比，能全面表明細胞內的生物學信息，因此細胞代謝組學的建立能幫助我們更加清晰地了解乳酸菌的抗氧化特性。總之，隨著乳酸菌抗氧化特性研究的深入和科研工作者對乳酸菌關注的增多，乳酸菌抗氧化產品必將在功能性食品和藥品中占據主要地位。