綠薄荷精油對溫和氣單胞菌群體感應現象及其腐敗特性的抑制作用

梅永超，李婷婷*，劉 楠，王當豐，赫彬彬，勵建榮,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.大連民族大學生命科學學院，遼寧 大連 116600）

群體感應（quorum sensing，QS）是細菌細胞間交流的一種通訊機制，具有QS機制的細菌通過感知環境中低分子質量、可擴散的信號分子來調控菌體密度，并在信號分子達到閾值時啟動相關基因表達，從而調控細菌的生理行為，以適應環境的變化[1-2]。研究表明，細菌的相關腐敗特性，如生物被膜的形成、胞外蛋白酶、嗜鐵素的產生等均依賴于QS系統的調控[3]。溫和氣單胞菌是魚類等水產品低溫貯藏過程中常見的腐敗菌之一，且能夠產生N-酰基高絲氨酸內酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）來調控其生物特性的表達[4-5]，以QS信號分子為靶點來阻斷QS系統已成為水產品防腐保鮮的一種新策略。阻斷或干擾細菌QS機制，主要有以下3 種途徑[6-7]：抑制信號分子的合成，如利用三氯生抑制合成AHLs前體物質的酶活力；降解信號分子活性，如利用內酯酶水解AHLs的內酯環，或利用酰基轉移酶水解AHLs的酰氨鍵；干擾信號分子與受體蛋白的結合，如合成信號分子結構類似物與信號分子受體蛋白競爭性結合。其中，QS抑制劑（QS inhibitors，QSIs）是指那些可以阻斷細菌種內或種間信息交流，對細菌QS現象具有抑制或干擾作用的物質。目前，已發現的QSIs多存在安全性問題，且難以在實際生產中應用。

天然植物精油提取工藝成熟、原料來源廣泛，且具有安全、無毒的優點。從天然植物精油中尋找QS抑制劑日益受到人們的關注[8-9]。如Myszka等[10]發現百里香精油可有效抑制熒光假單胞菌KM121 QS現象及其生物被膜的形成。綠薄荷，亦稱留蘭香，為唇形科（Labiatae）薄荷屬（Mentha）直立多年生芳香草本植物，是世界上主要的香料植物之一，原產于南歐，在我國一些省份大面積種植[11]。綠薄荷精油是將其新鮮莖、葉等地上植株經水蒸氣蒸餾而得的一種天然的、淡黃或黃綠色澄清的油狀液體。其化學成分較為復雜，主要成分包括香芹酮、檸檬烯、蒎烯、月桂烯、桉葉油素、3-辛醇、薄荷酮等[12]。綠薄荷精油在日化、食品和醫藥領域應用廣泛[13]。在食品工業中，它是一種重要的調味香料和食品添加劑，常用于糖果（口香糖）、煙酒、冰淇淋等產品。此外，有研究表明，綠薄荷精油具有良好的抗菌、抗氧化作用[14]，可用作天然食品防腐保鮮劑，在果蔬[15]、牛奶[16]中已有報道。但目前綠薄荷精油作為QS抑制劑的研究卻鮮有報道。

本研究以綠薄荷精油為研究對象，探討綠薄荷精油對溫和氣單胞菌QS及其腐敗特性的抑制效果，為綠薄荷精油更廣泛的利用提供理論參考，同時也對豐富和創新水產品貯藏保鮮理論、提高水產品品質具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

紫色桿菌Chromobacterium violaceum 026（CV026）為C. violaceum ATCC 31532的mini-Tn5突變體，卡那霉素抗性，僅當存在外源AHLs時，菌株CV026產生特征性紫色色素。供試菌溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），從腐敗大菱鲆中分離、鑒定。兩種菌株均為生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心保藏，在28 ℃、160 r/min條件下搖床培養。

綠薄荷精油（含50%～70%香芹酮） 長沙冠香日化貿易有限公司；卡那霉素、冰醋酸國藥集團化學試劑有限公司；信號分子標準品（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL） 美國Sigma公司；甲醇、十二烷基硫酸鈉、正丁醇、醋酸異戊酯、乙酸乙酯 天津風船化學試劑有限公司；蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司；結晶紫 天津致遠化學試劑有限公司；載玻片 江蘇飛舟玻塑有限公司；鋅片 上海邁砷化工有限公司；LB肉湯（胰蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH（7.0±0.1））、LB營養瓊脂（胰蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、瓊脂15.0 g/L，pH（7.0±0.2）） 青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Biofuge Stratos冷凍高速離心機 美國Thermo公司；imark酶標儀 美國Bio-Rad公司；80i顯微鏡 日本尼康公司；SS-4800場發射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；7890N/5975氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用儀 美國Agilent公司；W-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；LRH系列生化培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抑菌活性及QSIs檢測

最小抑菌濃度實驗：菌株CV026與溫和氣單胞菌過夜活化兩次后，按2%接入量接種于新鮮LB肉湯中（培養菌株CV026的LB肉湯中需含有20 μg/mL卡那霉素），160 r/min振蕩培養16～18 h，與100 mL LB營養瓊脂培養基混合，倒平板，待凝固后用牛津杯打孔，將200 μL不同劑量的綠薄荷精油（2、4、6、8 μL/mL和10 μL/mL）加到孔中。將平板置于28 ℃條件下培養1～2 d，觀察菌株的產生情況。以體積分數50%甲醇溶液作為陰性對照。

QSIs檢測實驗：菌株CV026過夜活化兩次后，按2%接入量接種于含有20 μg/mL卡那霉素的新鮮LB肉湯中，160 r/min振蕩培養16～18 h，與100 mL含有20 μg/mL C6-HSL（信號分子）LB營養瓊脂培養基混合，倒平板，待凝固后用牛津杯打孔，將200 μL不同劑量的綠薄荷精油（0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL）加到孔中。將平板置于28 ℃條件下培養1～2 d，觀察紫色菌素的產生情況。以體積分數50%甲醇溶液作為陰性對照。

1.3.2 紫色菌素產量的測定

根據參考文獻[17]，菌株CV026過夜活化后，按1∶100（V/V）接種于含有不同劑量綠薄荷精油（0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL）的LB肉湯中，并加入20 μg/mL C6-HSL，160 r/min、28 ℃振蕩培養48 h。同時設立不加信號分子的實驗組，以測定綠薄荷精油對菌株CV026生長情況的影響。

依次吸取300 μL添加信號分子實驗組的培養液于1.5 mL離心管中，加入150 μL 10%十二烷基硫酸鈉，振蕩10 s，加入600 μL正丁醇，振蕩5 s，10 000 r/min離心5 min，吸取200 μL紫色上清液添加到96 孔板中，用酶標儀測定OD595nm，以體積分數50%甲醇溶液為陰性對照。

1.3.3 綠薄荷精油對溫和氣單胞菌生物被膜形成的影響

1.3.3.1 酶標板法測定生物被膜

參考文獻[18]，將過夜活化的溫和氣單胞菌分別與新鮮LB培養液按1∶100（V/V）混勻后，取1 mL分裝至無菌的離心管中，加入終劑量為0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL的綠薄荷精油，以加入等體積的體積分數50%甲醇溶液為陰性對照，等體積20 μg/mL C6-HSL為陽性對照，28 ℃靜置培養48 h，測定其菌液密度后，棄去培養液，用無菌水清洗3 次，無菌風干燥固定35 min，隨后加入1 mL 0.1 g/100 mL的結晶紫染色15 min（室溫下），用無菌水清洗干凈，溶解于體積分數33%冰醋酸溶液中，用酶標儀測定OD595nm。生物被膜相對生成率按公式（1）計算。

式中：OD595nm實驗組為某一實驗組測得的生物被膜的OD595nm；OD595nm陰性對照組為陰性對照組測得的生物被膜的OD595nm。

1.3.3.2 光學顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察生物被膜

載玻片（普通載玻片，25.4 mm×76.2 mm，厚度1～2 mm）預處理：置于體積分數2%鹽酸溶液中浸泡24 h后，用蒸餾水洗凈、烘干，滅菌備用。

鋅片（純度≥99.0%，厚度0.20 mm）預處理：將鋅片用拋光機打磨去除表面氧化層后，切割成10 mm×10 mm大小，然后放入無水乙醇中超聲15 min，再放入去離子水中超聲15 min，然后烘干，滅菌備用。

在無菌培養皿中加入10 mL含有1%溫和氣單胞菌菌液的LB肉湯，并分別加入終劑量為0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL的綠薄荷精油，混合均勻后放入處理后的載玻片或鋅片，28 ℃靜置培養72 h。同時，設立不添加綠薄荷精油的陰性對照組和添加C6-HSL信號分子的陽性對照組。

光學顯微鏡觀察：72 h后取出載玻片，無菌水沖洗，除去浮游菌及黏液，置于無菌培養皿中，加入適量甲醇固定15 min，再加入適量2%結晶紫溶液染色5 min后，用無菌水沖洗干凈，25 ℃下進行干燥，干燥后在光學顯微鏡下觀察，拍照記錄。

掃描電子顯微鏡觀察：72 h后取出鋅片，用無菌水反復沖洗3～5 次，將鋅片放入4 ℃預冷的體積分數2.5%戊二醛溶液中浸泡4 h，取出后，梯度體積分數乙醇脫水，再經醋酸異戊酯置換兩次，自然干燥后噴金處理，用掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.4 綠薄荷精油對溫和氣單胞菌胞外蛋白酶活力的影響

根據文獻[19]，制作牛奶瓊脂平板，用牛津杯打孔，加入含有不同劑量（0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL）綠薄荷精油過夜培養的溫和氣單胞菌菌液，28 ℃靜置培養18～24 h。蛋白酶水解酪蛋白后，在孔周圍出現明顯的水解圈，水解圈越大，胞外蛋白酶活力越高。以不加綠薄荷精油的菌液為陰性對照，以添加C6-HSL信號分子為陽性對照。每個處理3 個平行，用游標卡尺測量其直徑。

1.3.5 綠薄荷精油對溫和氣單胞菌群集和泳動的影響

參考文獻[20]，將綠薄荷精油經0.22 μm的濾膜過濾除菌后，與冷卻至40 ℃群集的瓊脂培養基（1%蛋白胨（質量分數計，下同）、0.5%氯化鈉、0.5%瓊脂和0.5%葡萄糖）和泳動的瓊脂培養基（1%胰蛋白胨、0.5%氯化鈉、0.3%瓊脂）混勻，倒平板，使平板中綠薄荷精油的終劑量為0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL，向冷卻的平板中央加入5 μL過夜活化兩次的溫和氣單胞菌菌液，無菌風吹干，28 ℃恒溫培養48 h，觀察測試菌的遷移情況。以不加綠薄荷精油的菌液為陰性對照，以添加C6-HSL信號分子為陽性對照。每個處理3 個平行。

1.3.6 GC-MS定量分析綠薄荷精油對溫和氣單胞菌產AHLs的影響

AHLs粗提液的制備：將活化好的溫和氣單胞菌接種于含有200 mL LB肉湯的錐形瓶中，分別搖床培養（28 ℃、160 r/min）12、24、36 h和48 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用等體積酸化乙酸乙酯（含體積分數0.1%冰乙酸溶液）提取兩次，旋轉蒸發蒸干有機溶劑（35 ℃，真空度0.1 MPa），用1 mL甲醇溶解殘留物，-20 ℃保存備用。綠薄荷精油處理組LB肉湯中需含有2 mg/mL的綠薄荷精油，其余操作同上。

定量方法：AHLs粗提液采用內標法進行GC-MS檢測。選擇與AHLs具有相似結構（內酯環）且待測粗提取液中不能檢出的AHLs標準品作為內標物。經前期研究[21]發現，溫和氣單胞菌不分泌C14-HSL，因此統一添加2 μL 2 mg/mL的C14-HSL標準品溶液作為內標物到各組粗提取液（1 mL）中，在離子檢測（m/z 143）模式下對粗提取液中的AHLs進行定量研究，計算公式如式（2）所示。

式中：C1為樣品中Cn-HSL的質量濃度/（μg/mL）；S1為樣品中Cn-HSL對應的峰面積。

制作含有6 種AHLs標準品（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL）的混合標準品溶液（溶劑為甲醇，質量濃度200 μg/mL），GC-MS檢測，確定各類型標準品的保留時間。

GC-MS條件：色譜柱為HP-5MS石英毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為高純度氦氣，流速為l mL/min；進樣口溫度250 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；升溫程序：初溫150 ℃，以10 ℃/min升溫至220 ℃，保持7 min；接著以5 ℃/min升至250 ℃，保持6 min；最終以0.5 ℃/min升溫至252.5 ℃，保持5 min。進樣量1 μL，溶劑延遲3 min，分流進樣，分流比50∶1，運行總時間18 min。電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃。選擇離子檢測（m/z 143）模式。

2 結果與分析

2.1 抑菌效果及QSIs活性

圖 1 綠薄荷精油對紫色桿菌CV026產紫色素的抑制活性Fig. 1 Inhibitory activity of spearmint oil on violacein production of CV026

通過觀察實驗菌株的生長情況，發現綠薄荷精油劑量為2、4、6、8、10 μL/mL時，對菌株CV026的最小抑菌劑量為4 μL/mL。隨后對溫和氣單胞菌進行抑菌實驗，發現在相同劑量范圍內，綠薄荷精油對溫和氣單胞菌并無抑菌作用。因此選取亞抑菌劑量（4 μL/mL以下劑量）的綠薄荷精油進行QSIs檢測實驗，并設置實驗劑量為0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL。圖1表示在亞抑菌劑量下，綠薄荷精油對紫色桿菌CV026 QS活性的影響。從圖中可以看出添加綠薄荷精油的孔徑周圍出現白色、渾濁、不透明的抑制圈，表明綠薄荷精油具有抑制菌株CV026產生特征性紫色素的能力。

2.2 紫色菌素定量分析

通過酶標法測定菌株CV026紫色菌素產量，其相對下降量可反映綠薄荷精油對菌株CV026 QS現象的抑制程度。如圖2所示，隨著綠薄荷精油劑量的升高，菌株CV026紫色菌素產量呈劑量依賴性下降。與未添加精油相比，當綠薄荷精油劑量為2.0 μL/mL時，菌株CV026紫色菌素產量的下降率達56.17%。同時，研究不同劑量下綠薄荷精油對菌株CV026生長的影響，結果表明，綠薄荷精油并未對菌株CV026菌液密度造成影響，進而說明其并未抑制菌株CV026的生長代謝，而是通過干擾菌株CV026的QS系統，使其紫色菌素的產生受到了抑制。

圖 2 不同劑量綠薄荷精油對紫色桿菌CV026紫色菌素產生和菌液密度的影響Fig. 2 Effect of spearmint oil on violacein production of CV026

2.3 綠薄荷精油對溫和氣單胞菌生物被膜形成的影響

2.3.1 酶標板法測定生物被膜

生物被膜指微生物為適應生存環境而附著于生物或非生物物質接觸表面，利用多糖基質將自身包裹而形成的一種聚集體膜樣物。生物被膜廣泛存在于由金屬、塑料、玻璃等各類材料制成的食品機械設備表面，難以徹底清除，且極易導致食品微生物污染，從而造成嚴重的食品安全問題和經濟損失[22]。Aswathanarayan等[23]研究表明，微生物生物被膜的形成受QS系統調控。因此，本研究通過干擾QS系統為靶點來控制生物被膜的形成。從圖3可以看出，以空白組為基準（生物被膜相對生成率100%），添加C6-HSL信號分子的陽性對照組生物被膜相對生成率明顯增高，進一步說明溫和氣單胞菌生物被膜生成受QS系統的調控。此外，隨著綠薄荷精油劑量的增大，該菌株生物被膜生成率隨之減小，而菌液密度未受影響。這說明，綠薄荷精油可通過干擾、抑制QS系統來調控溫和氣單胞菌生物被膜的生成，且未對菌株有致死或抑制作用。

圖 3 不同劑量綠薄荷精油對溫和氣單胞菌生物被膜生成率的影響Fig. 3 Effect of spearmint oil on biofilm formation of Aeromonas sobria

2.3.2 光學顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察生物被膜

圖 4 綠薄荷精油對溫和氣單胞菌生物被膜影響的光學顯微鏡圖Fig. 4 Optical micrographs of Aeromonas sobria biofilm

由圖4a、b可見，經染色的菌體緊密相連形成大片的紫色膜狀物，且添加C6-HSL信號分子的陽性對照組，還出現局部菌體聚集成具有層次感的深紫色團狀物；對比綠薄荷精油處理組（圖4c～f），經結晶紫染色后，隨著添加劑量的升高，菌體難以在載體上牢固附著、易被沖散，未見菌體聚集形成大片紫色膜狀物，僅有少量菌體相連且膜狀物分布稀疏。

利用掃描電子顯微鏡可清晰直觀地觀察生物被膜微觀結構的變化。

圖 5 綠薄荷精油對溫和氣單胞菌生物被膜影響的掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 Scanning electron microscopic images of Aeromonas sobria biofilm

如圖5a、b所示，菌體被胞外聚合物層層包裹形成復雜的三維立體網絡結構，并覆蓋整個載體表面，單一菌體難以顯現。添加C6-HSL信號分子的陽性對照組，生物被膜形態更為致密。

圖5c～f為綠薄荷精油處理組，隨著綠薄荷精油劑量的升高，網絡結構退化并逐漸解體，胞外聚合物明顯減少且僅有少量菌體被包裹其中。據此，推測綠薄荷精油可通過抑制胞外聚合物形成，來減弱溫和氣單胞菌的成膜能力。

2.4 綠薄荷精油對溫和氣單胞菌胞外蛋白酶活力的影響

溫和氣單胞菌是魚類等水產品中常見的腐敗菌，具有分泌蛋白水解酶的能力。其致腐機理是利用蛋白酶水解水產品中蛋白質及游離氨基酸，促進自身生長繁殖，從而加速腐敗進程，導致水產品風味和品質劣變，甚至產生有毒有害物質[24]。葛靜慧等[25]發現降解海參優勢腐敗菌消化嗜冷桿菌（Psychro-bacter alimentarius）的AHLs可阻斷其蛋白酶的產生。趙麗珺等[26]研究發現冷卻豬肉中常見的產蛋白酶的腐敗菌（假單胞菌和沙雷氏菌）均受AHLs介導的QS系統調控。

圖 6 綠薄荷精油對溫和氣單胞菌胞外蛋白酶活力的影響Fig. 6 Effect of spearmint oil on protease activity of Aeromonas sobria

如圖6所示，當外源C6-HSL信號分子存在時，蛋白酶水解圈顯著增大。添加綠薄荷精油使蛋白酶水解圈直徑明顯減小，且水解圈直徑與綠薄荷精油劑量呈負相關。這表明溫和氣單胞菌胞外蛋白酶活力受QS系統調控，且綠薄荷精油可通過干擾QS系統，調控溫和氣單胞菌胞外蛋白酶的產生。

2.5 綠薄荷精油對溫和氣單胞菌群集和泳動的影響

群集和泳動是細菌在接觸表面遷移的兩種方式，群集運動特指發生在大于0.45%的瓊脂上的表面遷移，而泳動則指發生在小于0.45%的瓊脂培養基上的遷移[27]。細菌的運動性被證實在定植到宿主表面及后繼形成生物被膜的過程中發揮著關鍵作用[28]。Merritt等[29]認為耶爾森鼠疫桿菌的泳動和群集運動受通過QS系統調控的生物表面活性劑的影響。Daniels等[30]還發現QS系統可通過調節群集細胞的分化、鞭毛基因的合成及細菌表面活性物質的產生而參與到不同種類細菌的群集運動。

圖 7 綠薄荷精油對溫和氣單胞菌群集、泳動運動的影響Fig. 7 Effect of spearmint oil on swarming and swimming motility of Aeromonas sobria

圖 8 綠薄荷精油對溫和氣單胞菌運動區直徑的影響Fig. 8 Effect of spearmint oil on diameter of the motility zone of Aeromonas sobria

從圖7、8中可以看出，添加C6-HSL信號分子的陽性對照組較空白組菌株的運動性明顯增強。綠薄荷精油的添加與溫和氣單胞菌群集和泳動運動特性呈負相關，且有一定的劑量依賴性。這與Merritt[29]和Daniels[30]等的研究結果相一致，且與2.3節中綠薄荷精油對生物被膜的抑制作用呈現一致性。

2.6 GC-MS定量分析綠薄荷精油對溫和氣單胞菌產AHLs的影響

圖 9 AHLs混合標準品GC譜圖Fig. 9 GC of mixed AHLs standards

從圖9可以看出，各峰分離良好，峰形尖銳呈對稱狀，C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL在設定時間內完全分離，保留時間分別為4.408、6.254、8.305、10.685、13.374、16.882 min。

由表1可以看出，0～12 h，溫和氣單胞菌分泌AHLs主要是C8-HSL和C12-HSL，24～48 h為C4-HSL和C8-HSL；在整個實驗周期內，C8-HSL的分泌量一直較高。在菌株生長初期（0～12 h）菌株分泌的信號分子不僅種類少且質量濃度很低；隨著菌株的生長（12 h以后），信號分子的種類逐漸增加，質量濃度也急劇上升，同時長鏈的信號分子C12-HSL不再出現，其原因可能是隨著菌株的生長和培養基內的營養物質不斷消耗，pH值升高導致菌株生長環境發生改變，從而導致長鏈的信號分子內酯環斷裂。與空白組對比，經綠薄荷精油處理的實驗組信號分子的種類未發生變化，但其質量濃度明顯下降，說明綠薄荷精油能夠抑制溫和氣單胞菌QS信號分子的分泌。

3 結 論

本研究利用紫色桿菌CV026作為QS現象檢測對象，驗證了綠薄荷精油在亞抑菌劑量下對細菌QS系統的抑制作用。結果表明，綠薄荷精油具有降低菌株CV026產紫色菌素的能力，其劑量為2 μL/mL時，對紫色菌素的抑制率達56.17%；溫和氣單胞菌某些與腐敗相關的生物特性（生物被膜、胞外蛋白酶活力、泳動和群集運動）均受

到QS系統的調控，添加一定劑量的綠薄荷精油能夠達到抑制這些生物特性表達的目的，且隨著劑量的增加，其抑制效果更趨明顯。此外，GC-MS檢測結果表明，綠薄荷精油能夠有效抑制溫和氣單胞菌分泌AHLs。因此，綠薄荷精油具有良好的QS抑制活性，可作為新型的QS抑制劑用于水產品防腐保鮮。但是，目前綠薄荷精油對QS系統信號分子分泌、受體蛋白的結合以及相關調控基因表達的抑制機理還未明晰，需要進一步研究。