發酵溫度對南極磷蝦蝦醬流變特性和風味品質的影響

王 聰，樊 燕*，李兆杰，薛 勇，侯 虎，薛長湖

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

蝦醬是我國沿海地區及東南亞各國常見的調味品之一，是小型蝦在高鹽條件下利用傳統發酵方法制成的紫紅色黏稠狀食品[1]。因其含有大量的必需氨基酸和不飽和脂肪酸等營養物質，同時具有鮮美獨特的風味，深受沿海居民的喜愛[2]。南極磷蝦（Euphausia superba）生物量巨大，蛋白質量分數約為11.9%～15.4%，且富含人體所需的全部9 種必需氨基酸，是地球上最大的動物蛋白庫之一[3-4]。南極磷蝦蛋白營養價值極高，其生物價優于牛奶蛋白和其他動物蛋白，僅次于雞蛋蛋白[5]，是生產發酵蝦醬的理想原料。

蝦醬發酵過程伴隨著復雜的微生物、理化和生化變化，蛋白質、糖類、脂肪等物質在內源酶和微生物酶的作用下發生降解及進一步反應[6-7]。這些反應一方面產生多肽、氨基酸等營養物質和多種風味成分，影響產品的營養價值和風味[8]；另一方面會改變產品的組織結構，影響產品的質地和流動性[9]。利用有效的分析檢測技術，研究發酵食品的特征風味及風味形成機理已成為研究者關注的問題。頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）聯用技術操作簡單，又具有樣品用量少、檢測限低、精度高等優點，是目前食品行業常用的揮發性成分分離與鑒定方法。Kleekayai等[10]利用SPMEGC-MS聯用技術分析了泰國傳統發酵蝦醬Kapi中的揮發性風味成分，結果表明，Kapi的主要呈香物質是含氮化合物，尤其是吡嗪類物質。李瑩等[11]采用SPME-GC-MS結合保留指數方法分析傳統錦州蝦醬中的揮發性物質，并對萃取條件進行優化，共得到44 種揮發性化合物，主要包括醛類、酮類、酯類、酸類、酚類、烷烴類和吡嗪類物質。目前，國內外對于蝦醬的研究主要集中于生產工藝、營養成分、生物活性物質及菌株分離純化等方面，對其流變特性，尤其對產品品質與流變特性之間的定量關系研究尚鮮見報道[12-14]。對于醬體食品，流變特性的優劣能直接決定食品的口感和生產、貯存過程中的穩定性，對保證產品的品質具有重要意義[15]。

溫度是影響發酵的重要因素之一。本實驗以南極磷蝦為原料，在不同溫度條件下發酵制備蝦醬，利用流變儀在靜態和動態流動模式下測定流變特征參數，對其流變特性進行比較分析；采用SPME-GC-MS分離鑒定南極磷蝦蝦醬中的揮發性風味物質組成，結合感官評價，分析蝦醬風味品質變化規律，為優化傳統蝦醬的生產工藝和提高產品品質提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦（Euphausia superba）購于中國水產有限公司，于-18 ℃冰箱中貯存備用。

2-甲氧基-5-硝基吡啶（純度99%） 北京百威科技有限公司；甲醇（色譜純） 霍尼偉東（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

DS-1型高速組織搗碎機 上海標本模型廠；SPX智能型生化培養箱 寧波市科技園區新江南儀器有限公司；MCR101型流變儀 奧地利安東帕有限公司；AB135-S型精密電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 邦西科技有限公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取頭、SPME手動進樣柄、HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細管色譜柱、6890N-5973i GC-MS聯用儀 美國安捷倫公司；15 mL棕色頂空萃取瓶 上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦蝦醬制備

南極磷蝦解凍后挑選、去除雜質，用組織搗碎機打碎成蝦糜，稱取蝦糜600 g并按蝦糜質量的18%添加食鹽后充分混合均勻，裝入經消毒的250 mL加膠塞錐形瓶中，置于恒溫培養箱中分別在15 ℃（AK-1）、25 ℃（AK-2）、35 ℃（AK-3）條件下發酵15 d，發酵期間每隔3 d取樣一次，分別記為D0（發酵0 d）、D3（發酵3 d）、D6（發酵6 d）、D9（發酵9 d）、D12（發酵12 d）、D15（發酵15 d）。

1.3.2 流變特征參數

采用MCR101型流變儀，選擇直徑為50 mm的不銹鋼平行板測量系統，平行板間距為1 mm。

1.3.2.1 靜態流變性質

剪切速率對表觀黏度的影響：固定流變儀溫度為25 ℃，使剪切速率從0.1 s-1上升到1 000 s-1，記錄整個過程表觀黏度隨剪切速率的變化情況。

1.3.2.2 動態流變性質

在進行動態流變性質測定時，需要在線性黏彈區域內進行，才能不破壞樣品的結構。線性黏彈區是指復合模量G*（G*＝G+iG”）隨振蕩應變的變化而恒定的區域。在振蕩應變為0.1%～1.0%的范圍內，蝦醬樣品的復合模量G*與應變呈線性關系，因此本實驗選擇0.5%的振蕩應變來測定南極磷蝦蝦醬的動態流變性質。

頻率掃描：固定流變儀溫度為25 ℃，振蕩頻率范圍為0.1～10 Hz，測定頻率掃描過程中儲能模量G’、損耗模量G”和損失正切tan δ（tan δ＝G”/G’）的變化。

溫度掃描：溫度掃描范圍為10～100 ℃，升溫速率為0.5 ℃/s，振蕩頻率為1 Hz，測定溫度掃描過程中儲能模量G’、損耗模量G”和損失正切tan δ（tan δ＝G”/G’）的變化。

1.3.3 揮發性風味成分分析

1.3.3.1 SPME條件

準確稱取3 g（精確到0.001 g）樣品裝入15 mL頂空萃取瓶中，同時加入10 μL內標物2-甲氧基-5-硝基吡啶（50 mg/L），置于磁力攪拌臺上，設定攪拌轉速為300 r/min，85 ℃水浴加熱平衡10 min后，將萃取頭針管插入頂空瓶的硅膠瓶墊，伸出50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，萃取45 min后取出，迅速插入GC儀進樣口，250 ℃解吸5 min。

1.3.3.2 GC-MS條件

G C條件：色譜柱：H P-5 M S毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初溫35 ℃，保持3 min，以8.0 ℃/min升溫至250 ℃，保持10 min；進樣口和汽化室溫度均為250 ℃；載氣為He，體積流量1.3 mL/min，不分流。

MS條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；掃描周期2.84 次/s；質量掃描范圍m/z 50～500。

1.3.3.3 揮發性成分的定性及定量方法

定性方法參照文獻[16]：各揮發性成分經GC分離，用MS儀進行分析鑒定，將揮發性成分MS圖與計算機NIST標準譜庫進行匹配，僅報道正、反匹配度大于800（最大值為1 000）的鑒定結果。

定量方法參照文獻[17]：通過內標法計算待測揮發性成分的含量（假定各揮發性成分的絕對校正因子為1.0），計算公式如下。

式中：峰面積比例＝揮發性成分峰面積/內標物峰面積；5為內標物質量/μg；3為蝦醬樣品質量/g。

1.3.4 感官評價

感官評價參考李麗華等[18]的方法。選取10 名成員組成感官評定小組，在對樣品進行品評前，先對感官評定人員進行特殊培訓，使之對感官屬性的特征描述達成一致，以提高感官評價結果的準確性。對樣品的色澤、形態、滋味及香氣等感官屬性進行評分（表1），每個樣品重復3 次，評分結果取平均值。采用10 分制（0～10 分），其中8 分以上為最佳品質；6～8 分為較好品質；4～6 分為一般品質；4 分為感官評價可接受的界限，有腥味，蝦醬開始出現輕微分層，色澤變暗，但仍可以食用；4 分以下為不合格品質。

表 1 南極磷蝦蝦醬的感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of krill paste

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦蝦醬的流變特性

2.1.1 靜態流變性質

圖 1 不同溫度發酵過程中南極磷蝦蝦醬的流動曲線Fig. 1 Flowing curves of Antarctic krill pastes fermented at different temperatures

剪切速率對不同溫度發酵過程中南極磷蝦蝦醬表觀黏度的影響如圖1所示。隨著剪切速率的增大，蝦醬的表觀黏度下降，當剪切速率大于400 s-1后，表觀黏度的變化趨于平緩，說明該南極磷蝦蝦醬是具有剪切變稀特性的非牛頓流體，與文獻[19]報道的結果一致。蝦醬體系的表觀黏度主要取決于蛋白質分子間的相互作用。靜止時，大分子蛋白質相互交聯形成網狀結構，受到剪切力的作用，分子間的相互纏結被破壞，流層間的黏滯阻力下降，表觀黏度減小。隨著剪切運動的進行，蛋白質分子沿流動方向重新排列成線，當剪切速率增大到某一值時，這種排列逐漸完善，表觀黏度趨于穩定[20]。

溫度是調控各種生化反應和影響微生物生長的重要因素。15 ℃發酵時，發酵時間對蝦醬表觀黏度影響相對較小，這可能是因為，在低溫條件下，蝦醬中的酶活力較弱，微生物生長繁殖速率緩慢，發酵作用不顯著；隨著發酵溫度的升高，微生物代謝速率增加，內源性蛋白酶和微生物蛋白酶活力增強，促進蛋白質分解，發酵時間對蝦醬表觀黏度的影響顯著。當發酵溫度為35 ℃時，不同時期樣品間的表觀黏度差異最大，且隨著發酵時間的延長迅速下降。剪切速率相同時，不同發酵溫度下同一發酵時期的蝦醬樣品的表觀黏度大小順序為：AK-2＞AK-1＞AK-3，且AK-3的表觀黏度明顯小于AK-1和AK-2。隨著溫度的升高，蛋白質降解生成多肽、氨基酸和其他小分子含氮化合物，從而破壞了蛋白質分子之間的交聯，使原來的緊密連接的蛋白網狀結構劣化而變得松散，導致表觀黏度減小[21-22]。

另外，25 ℃發酵蝦醬的表觀黏度在發酵前期隨時間的延長呈遞增趨勢，并在發酵9 d時達到最大，后又迅速減小。這可能是因為發酵初始階段，在蛋白酶的水解作用下，更多的疏水基團被暴露出來，蛋白質分子的疏水相互作用得到加強[23]；另一方面，微生物生長繁殖分解碳水化合物產生有機酸，使體系pH值下降，逐漸接近蛋白質的等電點，分子間靜電斥力減弱，有利于蛋白質分子的聚集[24]。但當發酵超過9 d后，蛋白酶的水解作用占據主導，蝦醬中的大量蛋白質被酶解，分子鏈斷裂，蝦醬蛋白質網絡骨架被大范圍破壞，此時再增強分子間的相互作用力也無法阻止體系交聯結構的弱化和黏度的下降[25]。

2.1.2 動態流變性質

2.1.2.1 頻率掃描

圖 2 不同溫度發酵過程中南極磷蝦蝦醬的G’、G”和tan δ在頻率掃描中的變化Fig. 2 Frequency-dependent changes in G’, G” and tan δ of Antarctic krill pastes fermented at different temperatures

G’反映材料在發生形變時儲存能量的能力和彈性大小，G”反映材料在發生形變時釋放能量的能力和黏性大小。體系的黏彈性由tan δ（G”/G’）表示，tan δ＞1，體系中黏性成分占主導，表現流體的特征；tan δ＜1，體系中彈性成分占主導，表現固體的特征[26]。由圖2可知，在整個頻率范圍內，蝦醬樣品的G’始終明顯大于G”，即tan δ＜1，呈現出類固體的弱凝膠特性。根據黏彈性模量與頻率的關系，蛋白凝膠可分為糾纏態網絡（生物聚合體，強頻率依賴性）、化學凝膠（共價交聯，非頻率依賴性）和物理凝膠（非共價連接，弱頻率依賴性）[27]。從圖2可以觀察到，隨著頻率的升高，G’緩慢增大，表現為較小的頻率依賴性，且G’和G”無交叉；因此可以判定南極磷蝦蝦醬蛋白凝膠體系屬于以非共價鍵連接為主的物理凝膠。

AK-3不同發酵時期的樣品G’差距最大，AK-2次之，AK-1的G’相差最小。在相同頻率下，AK-2發酵9 d的G’明顯高于其他樣品，由靜態流變特性的分析可知，此樣品的黏度也最大，說明此發酵條件下的蝦醬因蛋白分子的交聯增強而內部結構更緊密，在遭受變形后的能量恢復能力較強。最低的G’出現在AK-3發酵后期的樣品中，G”的變化趨勢與G’相同，G’的下降表明了體系凝膠結構的弱化[28]。

2.1.2.2 溫度掃描

從圖3可以看出，當溫度由10 ℃程序升溫至100 ℃ 時，體系的G’和G”均顯著減小，但在整個升溫過程中，G’始終大于G”，表明體系的黏彈性隨著溫度的升高而逐漸下降，但依然維持著弱凝膠結構。氫鍵、疏水相互作用、靜電斥力等非共價鍵以及二硫鍵是維持蛋白凝膠結構的主要化學作用力[29]。初始升溫過程中，蛋白質分子運動加劇，分子間距增大，蛋白網絡結構變得疏松，松散結合的分子會隨溫度的升高更加劇烈地運動，導致分子鏈斷裂，體系的G’和G”下降。該過程中蝦醬體系凝膠結構的軟化主要是由蛋白質分子間氫鍵作用力的減弱引起的。隨著溫度的繼續升高，蛋白質變性，蛋白分子間發生聚集，最后形成沉淀。形成沉淀的蛋白聚集體不利于蛋白膠粒之間的相互連接，導致蛋白凝膠網絡結構的弱化。此過程中G’和G”的下降取決于疏水相互作用、靜電斥力或二硫鍵。

圖 3 不同溫度發酵過程中南極磷蝦蝦醬的G’、G”和tan δ 在溫度掃描中的變化Fig. 3 Temperature-dependent changes in G’, G” and tan δ of Antarctic krill pastes fermented at different temperatures

在相同溫度下，AK-2的G’和G”略高于AK-1，且明顯高于AK-3的G’和G”。AK-2發酵過程中的G’和G”呈現先上升后下降的趨勢，并于發酵9 d時達到最大，這與靜態流變學測定的結果相吻合。

2.2 揮發性風味成分分析

通過GC-MS檢測，并經NIST譜庫檢索分析，得到南極磷蝦蝦醬揮發性風味成分鑒定結果見表2。從南極磷蝦蝦醬中共分離鑒定出50 種揮發性風味物質，AK-1、AK-2和AK-3分別檢出39、41、37 種，主要由醛類、酯類、酮類、酸類、醇類、烴類及含氮、硫類化合物組成，其中對南極磷蝦蝦醬風味影響最大的是醛類和含氮、硫化合物。

已有研究表明，羰基化合物（包括醛類和酮類）是多種傳統腌臘肉制品中重要的揮發性風味物質，其賦予產品青香、水果香和堅果香等芳香特質[11]。醛類化合物因其閾值相對較低，具有很強的與其他物質重疊的風味效應，對產品整體香氣的形成有著顯著影響[30]，是南極磷蝦蝦醬中的主要揮發性風味成分。在南極磷蝦蝦醬中共檢測到9 種醛類化合物，具有風味活性的物質有7 種，其中苯甲醛、（E,E）-2,4-庚二烯醛、壬醛和癸醛在不同溫度發酵的蝦醬中均被檢出。這些醛類化合物主要來源于亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸的氧化分解，也有可能來源于氨基酸的Strecker降解[31]。在發酵期間，醛類化合物的含量隨發酵時間的延長基本呈上升趨勢，含量最高的是（E,E）-2,4-庚二烯醛，呈現出油脂香和青香；壬醛和癸醛次之，呈現出蠟香、橘香和植物香氣；苯甲醛在發酵后期含量較高，具有強烈的苦杏仁氣息。另外，AK-3于15 d還檢測出3-甲基丁醛和（E,E）-2,4-辛二烯醛，分別呈現堅果香和黃瓜的青香；AK-2檢測到（E,E）-2,4-辛二烯醛，具有花香和蜂蜜香。

不同溫度條件下發酵的蝦醬樣品中均檢出苯并噻唑，因在其他產品中含量普遍偏低而其感覺閾值較高（80 μg/kg），通常被認為對產品的風味貢獻不大。但在發酵過程中，其含量不斷增大并超過感覺閾值，因此可能為南極磷蝦蝦醬特有的風味物質。AK-2檢測出2 種吡嗪類物質，分別是3-乙基-2,5,-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪，具有烘烤香、堅果香和土豆香。吡嗪類化合物主要來源于氨基酸的Strecker降解，體現烤香和肉香，是多種發酵醬類食品中均有的重要呈香物質[10]。另外，AK-3于15 d檢測出三甲胺，它是海產生物中存在的氧化三甲胺經還原產生的；同時，南極磷蝦蝦醬中的其他胺類物質含量極高，這些胺類物質對水產品腥味、氨味的產生起著至關重要的作用，并會隨著貯藏時間的延長而含量繼續增加[32]。

2.3 感官評價

表 2 不同南極磷蝦蝦醬的揮發性風味成分及其含量Table 2 Volatile composition of different Antarctic krill pastes μg/kg

圖 4 不同溫度發酵過程中南極磷蝦蝦醬的感官特性Fig. 4 Sensory profiles of Antarctic krill pastes fermented at different temperatures during fermentation periods

由圖4可知，不同溫度發酵過程中的南極磷蝦蝦醬的色澤、香氣、滋味及整體評定結果無明顯差異。而在體態方面，AK-3發酵15 d的樣品評分明顯低于其他樣品，蝦醬發酵至12 d時即出現了分層現象，流變特性測定結果也顯示，發酵時間相同時，AK-3的黏度和黏彈性模量也低于其他兩組，說明發酵溫度過高、時間過長會劣化產品的組織結構，影響其口感。AK-1和AK-2均在12 d時感官評分最高，AK-3的感官評分在9 d時達到最高，且AK-2發酵12 d的感官評分略高于AK-1和AK-3。根據流變學測定結果，AK-2發酵9 d時具有最佳的流變特性，且AK-2中呈香化合物種類最為豐富；因此可初步判斷AK-2發酵9～12 d時的蝦醬具有最佳品質。

3 結 論

通過靜態和動態流變性質測定，結果表明南極磷蝦蝦醬形成了弱凝膠結構，是具有剪切變稀特性的非牛頓流體。發酵溫度越高，發酵過程中蝦醬的流變學特性變化越大，發酵溫度過高、發酵時間過長對蝦醬的凝膠結構有明顯的弱化作用，而25 ℃發酵能提高蝦醬的凝膠穩定性，發酵至9 d時樣品的表觀黏度、G’和G”達到最大。利用SPME-GC-MS技術從南極磷蝦蝦醬中共分離鑒定出50 種揮發性風味物質，其中對南極磷蝦蝦醬風味貢獻最大的是醛類和含氮、硫類化合物。南極磷蝦蝦醬的特征香氣以脂肪香、堅果香和青香為主，其特征風味物質是（E,E）-2,4-庚二烯醛、壬醛、癸醛、苯甲醛、3-乙基-2,5,-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪和苯并噻唑。25 ℃發酵9～12 d的南極磷蝦蝦醬具有最佳的流變學性質和風味特性，本研究結果可為優化傳統蝦醬的生產工藝和提高產品品質提供參考。