牛樟芝液體培養基優化及飲品加工工藝研究

謝春芹，許俊齊，曹正，凡軍民，謝正林，劉勇

（江蘇農林職業技術學院茶與食品科技學院，江蘇句容212400）

牛樟芝（Antrodia camphorata）又名樟芝、樟內菇、 牛樟菇等，屬于菌物界、擔子菌門、非褶菌目、多孔菌目、薄孔菌屬的珍稀藥用真菌[1]。早前，它就被臺灣原住居民用于治療長期飲酒造成的肝病，被譽為“森林中的紅寶石”和“藥王之王”[2-3]。

牛樟芝是我國臺灣特有的藥用真菌，由于僅生長于牛樟樹腐朽心材的內壁中或枯死倒伏之牛樟樹潮濕表面，生長非常緩慢，因此采集不易，加之人們過度采伐，牛樟樹數量日益銳減。目前，牛樟樹已被政府列為一級保護樹種[4-6]。由于牛樟芝子實體及菌絲體主要的化學成分含有三萜、多糖、腺苷等生物活性成分，且具有多種藥理活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗疲勞、保護肝臟和免疫調節活性，尤其對肝病具有顯著療效[7-8]。同時，牛樟芝還能減少運動后的乳酸產生，起到緩解體力疲勞的作用。其中的三萜類化合物是主要的抗腫瘤的活性成分，并具有抗氧化、抗炎癥、調節生物的免疫功能等多種功效[9-10]。

近年，牛樟芝產業得到快速發展，培育的地域不僅在我國臺灣，各地也開始迅速發展，但是牛樟芝在牛樟木屑上生長極為緩慢，無法滿足市場需求。本試驗通過單因素試驗和正交試驗篩選出適合牛樟芝菌絲生長的液體培養基，并在大量菌絲培養的基礎上，研究開發牛樟芝菌絲發酵飲品，以期為牛樟芝菌絲的進一步開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛樟芝菌種：江蘇食用菌研究所提供；黃原膠、果膠、纖維素酶（120 U/g）：任丘市力輝化工有限公司；濃縮橙汁、蔗糖等：市售，食品級；其余材料：市購所得。

FA2104N分析天平：上海精密科學儀器有限公司；DHG-9123A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；L520微波爐：合肥榮事達三洋電器股份有限公司；CH2176電磁爐：杭州九陽生活電器有限公司；HS-6恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；JZ-350色差計：深圳金準儀器設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛樟芝菌絲飲品加工步驟

1.2.1.1 菌種活化

將牛樟芝菌種接種到斜面培養基上，斜面培養基由以下質量百分含量的組分組成：18%～20%馬鈴薯；2%～2.5%葡萄糖；1.5%～2%蛋白胨；3%～4%乳糖；3%～4%酵母浸膏；0.6%～0.8%維生素 B1；5%～7%瓊脂；0.15%～0.2%K2HPO4；0.1%～0.2%MgSO4；余量為水。斜面培養基在17℃～22℃條件下暗培養7 d～8 d，待斜面長滿菌絲體。

斜面培養基的配制方法為：將新鮮馬鈴薯去皮，切成若干小塊（5 mm×5 mm），放入水中煮沸，文火15 min～20 min，用8層消毒紗布過濾，補足水分至1 000 mL，將蛋白胨、瓊脂、K2HPO4、MgSO4等加入，后將制備好的培養基趁熱分裝。加富培養基中加入酵母浸膏、乳糖相比較于PDA培養基提供更豐富的碳源、氮源，牛樟芝菌更好地利用吸收，利于菌絲的生長。

1.2.1.2 搖瓶培養

將經過斜面培養的牛樟芝菌種接種到搖瓶培養基中，一級搖瓶培養條件為接入經過斜面培養的牛樟芝菌種 1.5 cm2，以 150 r/min～200 r/min轉速，在 20℃～30℃條件下，振蕩培養7 d～8 d。

1.2.1.3 二級搖瓶培養

將一級搖瓶培養牛樟芝菌種的接種到搖瓶培養基中進行二級搖瓶培養，一級搖瓶培養的牛樟芝菌種與搖瓶培養基的體積比為10%～15%的接種量接種到搖瓶培養基中，以150 r/min～200 r/min轉速，在20℃～30℃條件下，培養5 d～8 d，所得牛樟芝菌種為生產搖瓶二級種。

1.2.1.4 發酵培養

將二級種接入發酵培養基中，二級種與發酵培養基的體積比為10%～16%的接種量接種于發酵培養基中，控制罐溫25℃～27℃，攪拌速度100 r/min～150 r/min，通氣量 1 ∶0.4～0.8 mL/mL·min，發酵培養 4 d～6 d，進行擴大培養，得到一級牛樟芝菌種。

1.2.1.5 發酵罐培養

一級牛樟芝菌種接入裝有發酵培養基的發酵罐中進行發酵罐培養，過濾，得牛樟芝菌絲體。

將發酵1 d的發酵液，放罐，發酵醪料經過濾，得新鮮的牛樟芝菌絲球，清洗過濾后的牛樟芝菌絲體及發酵液；將牛樟芝菌絲體及發酵液進行均質研磨，均質為采用二級均質工藝，將料液預熱至65℃～75℃，25 MPa～30 MPa下均質處理 10 min～15 min，隨后在15 MPa～20 MPa均質壓力下均質5 min～10 min。將牛樟芝菌絲球及發酵液在其中加入0.2%纖維素酶，混勻后于38℃條件下保溫水解1.5 h；將混合料在100℃下殺菌10 min；

1.2.1.6 牛樟芝菌絲飲品制備

先將蔗糖用少量軟水溶解過濾，然后分別加入牛樟芝菌絲球酶解濾液、溶化的果膠及黃原膠、檸檬酸、山梨酸鉀攪拌均勻，最后補水至配方規定的量；將定容后的料液加熱至沸，趁熱加灌入已滅菌的飲料瓶、壓蓋后105℃下殺菌10 min、冷卻后得牛樟芝菌絲發酵飲品。

1.2.2 液體培養基單因素試驗

前期試驗基礎上，判定碳源中麥芽糖、氮源中酵母浸膏與生長因素中維生素B1的添加量對牛樟芝液體培養基生長情況存在顯著影響，故設定麥芽糖添加比例為1%、2%、3%、4%、5%；酵母浸膏添加量為0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%；維生素B1添加量為0.45%、0.60%、0.75%、0.9%、1.05%，并以菌絲體鮮重及菌絲體生長狀況為評價指標，試驗重復3次，取平均值，確定三者最優的添加量。

1.2.3 正交試驗

從單因素中篩選出的不同水平的麥芽糖、酵母浸膏與維生素B1添加比例，制成不同配方的液體培養基進行L9（34），培養基正交試驗因素及水平設定具體見表1。每個處理3個重復，28℃條件下震蕩培養5 d，測定其菌絲體鮮重。

表1牛樟芝液體培養基正交L9（34）試驗因素與水平Table 1Factors and levels of L9（34）orthogonal liquid medium for Antrodia camphorata

1.2.4 正交試驗

在前期試驗基礎上，認為蔗糖、食鹽、檸檬酸+檸檬酸鈉及果膠+黃原膠為影響牛樟芝菌絲體發酵飲品的關鍵因素。分別設定蔗糖添加比例為4%、5%、6%；設置食鹽添加量為0.01%、0.02%、0.03%，設置檸檬酸與檸檬酸鈉添加比例為（0.3+0.03）%、（0.4+0.04）%、（0.5+0.05）%，設置果膠+黃原膠添加比例為（0.03+0.05）%、（0.04+0.09）%、（0.05+0.13）%，具體見表2。

表2牛樟芝菌絲發酵飲品L9（34）試驗因素與水平Table 2Factors and levels of L9（34）orthogonal fermented drinks for Antrodia camphora mycelium

1.2.5 指標測定方法

1.2.5.1 感官評定

取試樣置于燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態。聞其氣味，用溫開水漱口，品嘗滋味。感官品質得分為3個指標總和。感官評價由20位具有品評經驗的食品專業同學進行評價，取其平均值。

外觀（10分～30分）：細膩潤滑，組織連貫均一，無結塊和分層、無固體析出、色澤一致，無沉淀。

口感（10分～40分）：口感爽滑，口味醇厚。

風味（10分～30分）：飲品的酸甜度適中、飲品香氣濃厚，獨特飲品酵香。

1.2.5.2 牛樟芝菌絲體鮮重測定方法

牛樟芝菌絲體發酵液，采用100目篩網過濾，將菌絲體用蒸餾水沖洗數次，瀝干，稱重后，即得牛樟芝菌絲體鮮重。

1.2.5.3 微生物指標的測定

菌落總數按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》進行測定。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

牛樟芝液體菌種培養基中添加麥芽糖時，菌絲鮮重隨添加比例的增高，菌絲含量增加。原因在于麥芽糖屬于二糖，易于被牛樟芝菌絲體快速利用又可以滿足菌絲后期生長的需要。麥芽糖添加量對牛樟芝菌絲體鮮重的影響具體見圖1。

圖1 麥芽糖添加量對牛樟芝菌絲體鮮重的影響Fig.1 Effect of maltose addition on the fresh weight of Antrodia camphorata mycelium

由圖1分析得出，麥芽糖添加量為3%時，牛樟芝菌絲含量達到高點，當添加量為4%，菌絲鮮重與添加比例為3%時增加不明顯，故選擇麥芽糖添加量為3%作為最適培養基碳源比例。

酵母浸膏富含完全蛋白質，富含大量氨基酸、維生素、核苷酸及微量元素等，常被用作生物培養基原料，功效遠大于酵母，并對提高菌種的生產速率具有明顯作用。酵母浸膏添加量對牛樟芝菌絲體鮮重的影響見圖2。

由圖2分析可知，酵母浸膏的添加量對牛樟芝菌絲鮮重影響較為明顯，當添加量為0.6%時，每100 mL培養液中的菌絲鮮重達到8.76 g，隨添加比例增加，牛樟芝鮮重增加不明顯，原因可能在于，過量營養對于菌絲增長并無明顯作用，據此選擇0.6%的酵母浸膏添加量為最適液體培養基添加量。

維生素B1又稱硫胺素，常被用作液體培養基中的生長促進因子，在碳素化合物代謝過程中，具有一定促進作用。維生素B1添加量對牛樟芝菌絲體鮮重的影響見圖3。

圖2 酵母浸膏添加量對牛樟芝菌絲體鮮重的影響Fig.2 Effect of the amount of yeast extract on the fresh weight of Antrodia camphorata mycelium

圖3 維生素B1添加量對牛樟芝菌絲體鮮重的影響Fig.3 Effect of vitamin B1addition on fresh weight of Antrodia camphorata mycelium

由圖3分析得出，隨著維生素B1添加量的增加，存在于液體培養基中的牛樟芝菌絲鮮重呈現先增大再減小的趨勢，即為當添加量為0.75%時，菌絲鮮重達到9.55 g/100 mL，添加量增加至0.9%，菌絲體鮮重有所下降，但具體機理尚不清楚。故認為維生素B1添加量為0.75%為最適宜的添加量。

2.2 牛樟芝液體培養基工藝優化

2.2.1 正交試驗結果的極差分析

液體培養基L9（34）試驗結果分析見表3。

從表3牛樟芝液體培養基正交試驗結果中的R值可知，影響牛樟芝菌絲鮮重的因素主次順序為A＞B＞C，即麥芽糖添加量＞酵母浸膏添加量＞維生素B1添加量。依據菌絲鮮重的結果分析可知，優化的工藝組合均為A2B3C1，即麥芽糖的添加量為3.0%，酵母浸膏添加量控制在0.65%，維生素B1添加量0.65%，牛樟芝菌絲體鮮重達到最高值。

表3液體培養基L9（34）試驗結果分析Table 3Analysis of results of liquid medium L9（34）

表4 牛樟芝菌絲鮮重方差分析Table 4 Analysis of variance of fresh weight of Antrodia camphorata mycelium

對試驗結果進行方差分析，表4數據顯示，在本研究條件下，麥芽糖添加量對樣品菌絲鮮重的影響極顯著（P<0.01），酵母浸膏添加量對其影響顯著（P<0.05），而維生素B1添加量則對牛樟芝菌絲鮮重影響不顯著。

2.2.2 擴大性驗證試驗

雖然本研究獲得的優化方案A2B3C1，存在本次試驗中的6號試驗組，為了進一步確認其在實際生產中的可靠性與可行性，故以其為條件，即麥芽糖的添加量為3.0%，酵母浸膏添加量控制在0.65%，維生素B1添加量0.65%，進行擴大性（中試）驗證試驗，試驗重復3次，測定其鮮重平均值為14.58 g/100 mL，試驗結果優于正交試驗的9組試驗組，故認為此配方為較佳的牛樟芝液體培養基組成。

2.3 牛樟芝菌絲發酵飲品調配工藝優化

2.3.1 正交試驗結果的極差分析

牛樟芝菌絲發酵飲品調配L9（34）試驗結果見表5，牛樟芝菌絲鮮重方差分析見表6。

表5牛樟芝菌絲發酵飲品調配L9（34）試驗結果Table 5Test results of L9（34）of blended fermented drinks for Antrodia camphora mycelium

表6 牛樟芝菌絲鮮重方差分析Table 6 Analysis of variance of fresh weight of Antrodia camphorata mycelium

從表5牛樟芝菌絲發酵飲品調配工藝的正交試驗結果中的R值可知，影響其綜合評分的因素主次順序為C＞A＞B＞D，即檸檬酸+檸檬酸鈉＞蔗糖量＞食鹽添加量＞果膠+黃原膠。依據綜合評分的結果分析可知，優化的工藝組合均為A1B3C2D2，即蔗糖的添加量為4%，食鹽添加量控制在0.03%，檸檬酸0.4%+檸檬酸鈉0.04%，果膠0.04%及黃原膠0.09%。外觀、口感及風味的綜合值均保持在最高。

對試驗結果進行方差分析，表6數據顯示，在本研究條件下，檸檬酸+檸檬酸鈉添加量與蔗糖添加量對牛樟芝菌絲發酵飲品的綜合口感影響極顯著（P<0.01），食鹽添加量對其影響顯著（P<0.05），而果膠+黃原膠對其影響次之。

2.3.2 擴大性驗證試驗

雖然本研究獲得的優化方案A1B3C2D2，不存在本次試驗組中，為了進一步確認其在實際生產中的可靠性與可行性，故以其為條件，即牛樟芝菌絲飲品調配配方為蔗糖的添加量為4%，食鹽添加量控制在0.03%，檸檬酸0.4%+檸檬酸鈉0.04%，果膠0.04%及黃原膠0.09%，進行擴大性（中試）驗證試驗，試驗重復3次，經品評后，綜合得分達86.1分，試驗結果均優于正交試驗的9組試驗組，故認為此配方為較佳的牛樟芝菌絲飲品的適宜配方。

通過對在最佳工藝條件下制得的牛樟芝發酵菌絲飲料進行感官評價，其顏色均一，組織狀態均勻，無沉淀，具有牛樟芝飲品特有的風味，甜爽適口，無不良異味，口感順滑，無肉眼可見雜質。

2.4 微生物指標檢驗

牛樟芝菌絲飲品的微生物檢驗結果見表7。

表7 微生物檢驗結果Table 7 The results of microbiological test

由表7試驗結果分析表明，牛樟芝菌絲飲品的細菌總數≤100 CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/100 mL，致病菌未檢出，符合GB 7101-2015《食品安全國家標準飲料》中關于微生物限量的安全標準。

3 結論

對牛樟芝液體培養基碳源、氮源及生長因子優化，試驗結果認為，麥芽糖的添加量為3.0%，酵母浸膏添加量控制在0.65%，維生素B1添加量0.65%，牛樟芝菌絲體鮮重高于其他試驗組，達到14.58 g/100 mL最高值；在對牛樟芝菌絲發酵飲品調配工藝過程中，通過正交試驗分析得出，最優組合為蔗糖的添加量為5%，食鹽添加量控制在0.03%，檸檬酸0.4%+檸檬酸鈉0.04%，果膠0.04%及黃原膠0.09%，以綜合感官評價認為此配方制得的牛樟芝菌絲飲品，在保證口感的同時，后期貯藏驗證其穩定性也較高。

該牛樟芝菌絲發酵飲品，在保留牛樟芝菌絲原有的活性功能基礎之上，添加濃縮橙汁，使牛樟芝飲品的營養更加豐富，風味獨特，口感更加細膩，在市場上將有較好的市場前景。