AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附工藝的研究

（南陽(yáng)理工學(xué)院生化學(xué)院，河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽(yáng)473004）

艾草（Artemisia argyi），又稱香艾，為菊科草本植物，適宜生長(zhǎng)在溫帶地區(qū)，我國(guó)大部分地區(qū)均有生長(zhǎng)，主要產(chǎn)于山東、安徽、河北、河南、湖北等省[1-5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，艾草中含有的黃酮類化合物，具有降血脂、降血壓、抗血栓、抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老以及治療慢性前列腺炎等多種生理活性。艾草作為黃酮類化合物的天然載體，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[6-13]。

AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附的因素與吸附率之間的關(guān)系具有非線性特征。利用反向傳播（back propagation，BP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可對(duì)非線性數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的分析處理，使非線性關(guān)系的輸入量與輸出量具有關(guān)聯(lián)性，但在實(shí)際應(yīng)用中存在網(wǎng)絡(luò)全局搜索能力不足、易陷入局部最優(yōu)等缺陷[14-17]。遺傳算法是一種概率搜索算法，它的基本思想是通過(guò)全面模擬自然選擇和遺傳機(jī)制，通過(guò)對(duì)種群個(gè)體的選擇、雜交和變異，形成一種具有“生產(chǎn)+檢驗(yàn)”特征的搜索算法，該法具有全局最優(yōu)的特點(diǎn)，且能優(yōu)化BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的連接權(quán)值，可很好地克服BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)陷入局部最優(yōu)的缺陷，從而對(duì)形式未知的函數(shù)求出最優(yōu)解[18-22]。

本文在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附過(guò)程的數(shù)學(xué)模型，利用遺傳算法對(duì)所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全局尋優(yōu)，根據(jù)實(shí)際操作情況，將遺傳算法全局尋優(yōu)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)修正，確定AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附的最優(yōu)工藝，以期為艾草黃酮進(jìn)一步的生理活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 原料

艾草：南陽(yáng)市張仲景藥材市場(chǎng)，清洗，晾干，粉碎，備用。

1.2 試劑

蘆丁：中國(guó)藥品生物制品檢定所；氯仿、正丁醇、乙醇：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備

FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FA1004精密電子分析天平：上海天平儀器廠；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：無(wú)錫申科儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)、752N紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-40B臺(tái)式高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；300 mm×16 mm層析柱：上海摩速科學(xué)器材有限公司。

2 方法

2.1 艾草黃酮粗提液的制備

準(zhǔn)確稱取20 g艾草粉置于1 000 mL三角瓶中，按照料液比1∶25（g/mL）的比例加入70%乙醇，置于60℃、120 r/min的恒溫水浴振蕩器內(nèi)恒溫振蕩2 h，抽濾，濾液進(jìn)行真空濃縮，至沒(méi)有醇味。

2.2 Sevage法脫蛋白

量取適量艾草黃酮濃縮液于分液漏斗中，加入等體積的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇體積比為5∶1）劇烈振蕩20 min，靜置，去除蛋白層和有機(jī)溶劑層，取上清夜，反復(fù)多次操作，脫蛋白后的濃縮液置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 黃酮類化合物的測(cè)定

黃酮類化合物在亞硝酸鹽作用下，與Al（NO3）3發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成黃色鋁絡(luò)合物，在堿性條件下顯紅色，507 nm波長(zhǎng)下有最大吸收[23]，因此可采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以507 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，對(duì)比蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃酮含量。

2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取經(jīng)105℃烘干的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15 mg，用80%乙醇溶解，配制成0.15 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液100 mL，精密吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于7個(gè)潔凈的25mL容量瓶中，分別加入6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL 的 80%乙醇，然后再分別加入5%NaNO2溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置6 min，再分別加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置6 min，向每個(gè)容量瓶?jī)?nèi)加入10%NaOH溶液10.0mL，最后用80%乙醇定容，充分振蕩后靜置15 min，在507 nm處測(cè)吸光值[24]。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 上柱液濃度對(duì)吸附率的影響

配制不同濃度的艾草黃酮上柱液100 mL，其濃度分別為 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，pH5.0，以 0.8 mL/min的流速上柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，分步收集流出液（5 mL/管），以流出液的顏色為參考，上柱液達(dá)到泄露點(diǎn)時(shí)，停止上柱，計(jì)算吸附率。

2.5.2 上柱液流速對(duì)吸附率的影響

配制0.6 mg/mL的艾草黃酮上柱液100 mL，調(diào)節(jié)酸堿性使其 pH5.0，分別以 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL/min的流速上柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，分步收集流出液（5 mL/管），以流出液的顏色為參考，上柱液達(dá)到泄露點(diǎn)時(shí)，停止上柱，計(jì)算吸附率。

2.5.3 上柱液pH值對(duì)吸附率的影響

配制0.6 mg/mL艾草黃酮上柱液100 mL，分別調(diào)節(jié)pH 值為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，調(diào)節(jié)流速為 0.8 mL/min，收集流出的溶液（5 mL/管），以流出液的顏色為參考，上柱液達(dá)到泄露點(diǎn)時(shí)，停止上柱，計(jì)算吸附率。

2.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以上柱液濃度、流速、pH值3個(gè)因素為自變量，以吸附率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[25-26]，因素水平表如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

2.7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立

隨機(jī)選擇Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的12組試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)及訓(xùn)練樣本，其他3組試驗(yàn)數(shù)據(jù)用來(lái)檢驗(yàn)所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的泛化能力，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)的因素個(gè)數(shù)以及需要進(jìn)行優(yōu)化的指標(biāo)的個(gè)數(shù)，設(shè)計(jì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)[27]，選擇收斂精度10-3。

2.8 遺傳算法優(yōu)化

利用遺傳算法對(duì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行全局尋優(yōu)，以神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出值作為求解的目標(biāo)函數(shù)值，以Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)作為初始種群，種群規(guī)模12，交叉概率0.05，變異概率0.01[28]。

2.9 吸附率的計(jì)算

式中：V0為上柱液體積，mL；C0為起始濃度，mg/mL；Vr為流出液體積，mL；Cr為過(guò)柱液濃度，mg/mL。

3 結(jié)果與討論

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得一元線性回歸方程為：y=0.339 5x+0.007 8，R2=0.997 5

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 上柱液濃度對(duì)吸附率的影響

上柱液濃度對(duì)吸附率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 上柱液濃度對(duì)吸附率的影響Fig.2 The effect of upper column concentration on adsorption rate

由圖2可知，吸附率隨上柱液黃酮質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大，當(dāng)濃度大于1.0 mg/mL時(shí)吸附率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是由于大孔樹脂的吸附能力是有限的，當(dāng)樹脂吸附達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，隨著上柱液濃度的增加吸附率變化不明顯[29]。

3.2.2 上柱液流速對(duì)吸附率的影響

上柱液流速對(duì)吸附率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 上柱液流速對(duì)吸附率的影響Fig.3 The effect of flow velocity of upper column fluid on adsorption rate

由圖3可知，隨上柱液流速的增加，大孔樹脂對(duì)艾草黃酮的吸附率逐漸增大，當(dāng)上柱液流速大于0.8 mg/mL時(shí)，上柱液流速越大，樹脂對(duì)黃酮的吸附率越低，可能是上柱液流速過(guò)大時(shí)，黃酮類化合物未被樹脂充分吸附[30]。

3.2.3 上柱液pH值對(duì)吸附率的影響

上柱液pH值對(duì)吸附率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 上柱液pH值對(duì)吸附率的影響Fig.4 The effect of upper column pH on adsorption rate

由圖4可知，上柱液pH值對(duì)吸附率的影響較大，當(dāng)上柱液pH值小于5.0時(shí)，吸附率相對(duì)較高，可能是黃酮類化合物含有酸性基團(tuán)，在酸性條件下更易被大孔樹脂吸附，當(dāng)pH>5.0時(shí)，隨pH值的增大，吸附率明顯下降[29]。

3.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立

Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of Box-Behnken experiment

圖5 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練過(guò)程Fig.5 The training process of BP neural network

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)的結(jié)果，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附過(guò)程的數(shù)學(xué)模型，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)及訓(xùn)練過(guò)程如圖5所示。

由圖5可知，隨訓(xùn)練次數(shù)增多，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練誤差平方和逐漸減小，經(jīng)4 923次訓(xùn)練，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)收斂，收斂精度達(dá)10-3，說(shuō)明所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型逼近能力較強(qiáng)[31]，可模擬AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附過(guò)程。

3.4 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果

利用遺傳算法對(duì)所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全局尋優(yōu)，尋優(yōu)過(guò)程如圖6所示。

圖6 遺傳算法尋優(yōu)過(guò)程Fig.6 The optimizing computation process of genetic algorithm

經(jīng)過(guò)100代遺傳進(jìn)化，遺傳算法全局尋優(yōu)的結(jié)果為：上柱液濃度1.190 1 mg/mL，流速0.407 6 mL/min，pH4.682 6；最佳的目標(biāo)函數(shù)值即最優(yōu)適應(yīng)度（AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附率）為90.419 2%。為便于實(shí)際操作，將遺傳算法全局尋優(yōu)的結(jié)果適當(dāng)修正為：上柱液濃度 1.2 mg/mL，流速 0.4 mL/min，pH4.68。

3.5 最優(yōu)提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，并與遺傳算法全局尋優(yōu)修正后的結(jié)果相結(jié)合，確定AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附的最優(yōu)工藝為：上柱液濃度1.2 mg/mL，流速0.4 mL/min，pH4.68。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，在此條件下AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附率可達(dá)90.28%。4 結(jié)論

1）結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附過(guò)程的數(shù)學(xué)模型，經(jīng)4 923次學(xué)習(xí)及迭代訓(xùn)練，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型收斂，收斂精度達(dá)10-3，說(shuō)明所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)逼近輸入與輸出特性的能力比較強(qiáng)，可將其應(yīng)用于AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附工藝的優(yōu)化。

2）利用遺傳算法對(duì)所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全局尋優(yōu)，結(jié)合實(shí)際條件，將遺傳算法全局尋優(yōu)結(jié)果及單因素試驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合，確定AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附最優(yōu)工藝為：上柱液濃度1.2 mg/mL，流速0.4 mL/min，pH4.68。根據(jù)此條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，并取平均值，吸附率可達(dá)90.28%。

綜上，將單因素試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遺傳算法相結(jié)合優(yōu)化AB-8大孔樹脂對(duì)艾草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附工藝是可行的，也為其他中藥材中黃酮類化合物的分離純化研究提供了有益參考。