聚賴氨酸抑制冷藏魚糜制品優勢菌及品質影響

李唐飛，范大明，4，黃建聯，趙建新，4，*，閆博文，周文果，張文海，張灝，4

（1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學國家功能食品工程技術研究中心，江蘇無錫214122；3.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；4.江蘇省食品安全與質量協同創新中心，江蘇無錫214122；5.福建安井食品股份有限公司，福建廈門361022）

國內魚糜市場消費持續增長，消費者對魚糜產量和產品種類需求日益增加。傳統魚糜制品使用冷凍魚糜為原料，且產品貯藏常常采用低溫冷凍。這種長時間的冷凍貯藏出現蛋白質冷凍變性以及油脂氧化現象，致使魚糜制品的風味和品質下降[1]。采用冷藏的方式貯藏新鮮魚糜制品，能一定程度上減少魚糜制品品質的劣化。但是，由于魚糜制品是一種營養豐富的高水分產品，因此極易受到腐敗微生物的污染，貯藏期間微生物代謝繁殖會導致魚糜制品品質的降低以及營養的流失[2]。在生產過程常常使用高溫處理等方式降低微生物對魚糜制品帶來的損失，但這些傳統的處理方式不僅會破壞魚糜制品的風味和口感，且需要較高能耗[3]。因此選擇一種適合的殺菌抑菌處理方式是保證魚糜制品品質風味，延長產品貨架期的重要環節。

ε-聚賴氨酸（ε-L-polylysine，ε-PL）是一種由微生物分泌的天然廣譜性抑菌物質，具有α螺旋結構，主要由ε-氨基和α-羧基連接形成的具有多肽結構的生物堿[4]。ε-PL分子量一般為 2.5 kDa～4.5 kDa，較低聚合度的ε-聚賴氨酸呈現白色，高聚合度ε-聚賴氨酸呈現淡黃色且略帶苦味，有良好的水溶性。ε-聚賴氨酸具有較強的熱穩定性，在121℃下高壓處理也不會發生分解，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌都有良好的抑菌效果。聚合度小于10的ε-聚賴氨酸不具有抑菌效果，高聚合度抑菌效果良好[5]。聚賴氨酸因其具有較好的抑菌效果、安全無毒，穩定性強等優點，被廣泛應用于蛋類制品、米類制品等高蛋白食品中[6]。目前，聚賴氨酸已實現工業化生產，在如美國、日本、韓國等國家，聚賴氨酸均已被用作食品防腐劑，并已被廣泛使用[7]。

本研究以新鮮魚糜制品為研究對象，探究新鮮魚糜制品冷藏過程中菌相的變化，以及聚賴氨酸對貯藏期間優勢菌群的抑菌效果，以及對新鮮魚糜制品品質的影響，從而確定聚賴氨酸應用于魚糜制品中的最佳添加劑量。為今后即食魚糜制品生產和貯藏提供一種保證魚糜制品品質的抑菌方式，有助于魚糜產業產品進一步發展。

1 材料與方法

1.1 材料于試劑

新鮮白鰱魚：無錫農貿市場；食鹽：無錫華潤萬家超市；聚乙烯腸衣：福建安井食品有限公司提供；聚賴氨酸：強耀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MO－385型莫菲絞肉機：佛山桃花島電器有限公司；HLQ-10型斬拌機：上海申發機械有限公司；MP-15型雙槽恒溫水浴鍋：南京先歐儀器制造公司；SZ200手搖式灌腸機：南京威利朗食品機械有限公司；SU504手動式U型封口機：河北衡水鴻昊企業有限責任公司；TA.XTPlus物性分析儀：英國Stable Micro System公司；Hiseq PE 250：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 新鮮魚糜的制作

將購置的新鮮白鰱魚去頭、魚皮、魚鱗以及內臟后，手工采集魚肉，采集過程中，剔除不需要的紅肉部分。用絞肉機將魚肉絞碎并篩去魚骨。用5倍魚肉質量體積的5℃以下的自來水將所采魚肉漂洗2次，再用含0.3%的NaCl的5℃以下的自來水漂洗1次，每次漂洗5 min，靜置3 min后傾去水及表面雜質。用紗布擠壓脫水至水分為80%～85%為止。

1.3.2 魚糜前處理

將600g魚糜放入斬拌機中，斬拌速度為2600 r/min，在4℃左右的低溫下進行低速空斬2 min，空斬過程中每30秒停止斬拌10 s，直至魚糜抱團黏壁且無硬顆粒。稱取魚糜質量3%的食用鹽，均勻加入到魚糜中，4℃～10℃下鹽斬2 min至魚糜漿料呈現具有一定黏度的均勻漿狀。將ε-聚賴氨酸與少量水混合均勻，加入到魚糜魚漿中，在4℃～10℃下進行料斬。料斬時間為2 min，每30秒停止斬拌10 s。

1.3.3 魚腸的制作

使用斬拌完成的魚糜漿用灌腸機灌入直徑為2.5cm的聚乙烯腸衣中，將兩端使用封口機進行密封，放置于水浴鍋中進行二段式的水浴凝膠熟化，具體水浴條件為一段40℃水煮30 min，二段水浴條件為90℃水煮20 min[8]。熟化完成立即放入冰水里降溫。

1.3.4 低溫冷藏

將凝膠熟化冷卻后的魚腸進行分批貯藏，貯藏條件為4℃恒溫冷藏。

1.3.5 基因組測序

參考Tarnecki等[9]的方法，FastDNA SPIN Kit for Soil DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作參考試劑盒說明書。提取DNA后，對DNA進行PCR擴增和產物純化，PCR引物為341F和806R，擴增片段長度465bp，PCR 條件具體為95℃，5 min→（95℃，30 s；52℃，30 s；72℃，30 s）30個循環→72℃，7 min→12℃∞。PCR完成后對PCR產物膠進行回收，測量DNA濃度后上機測序。

1.3.6 最小抑菌濃度

參考Gunes等[10]，將純化后菌懸液用生理鹽水進行重懸，3 000 r/min離心3 min，重復兩遍。用液體培養基配置相應濃度的聚賴氨酸，采用二倍梯度法配制聚賴氨酸溶液。用聚賴氨酸溶液重懸，置于37℃搖床培養12 h后，取200 μL至96孔板，用酶標儀測量OD600。每樣品取3個平行。以空白液體培養基為陰性對照組，以抗生素為陽性對照組。

1.3.7 凝膠強度

將冷藏中的魚腸取出，剝去外部腸衣后切塊成25 mm圓柱體，保證圓柱體上下地面均勻。將圓柱體魚腸置于室溫，待其溫度上升至室溫后，用TA.XTPlus物性分析儀測定魚腸凝膠強度，采用球形探頭P/5S。具體測定參數為測定速度1.00 mm/s，測量下壓距離15 mm[11]。每組測量6個平行樣，取結果平均值，凝膠強度具體計算方法。

凝膠強度/（g·cm）=破斷強度（g）×破斷距離（cm）

1.3.8 持水性

取出冷藏的魚腸樣品，剝去魚腸外的腸衣部分，將魚腸切成質量為2 g左右的薄片。將薄片平鋪至稱量紙，稱量紙厚度為5層。采用冷凍離心機在4℃下8000r/min離心20min。離心完成后稱取魚腸片質量[12]。每組3個平行，結果取平均值，計算方法。

式中：Xw為持水性，%；W1為初始樣品質量，g；W2為離心后的樣品質量，g。

1.3.9 色澤

將冷藏魚腸切片，使用校準后的高精度分光測色儀進行測量，分別測量魚腸的亮度L*，紅色度a*，以及黃色度b*，每組重復6次平行，取6組平行的平均值[13]。計算方法如下。

1.3.10 菌落總數

采用平板菌落計數法，具體參考國標GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》。在營養瓊脂培養基上進行涂布、計數。取10 g冷藏魚糜樣品，樣品分別取魚腸兩端和中間等量，加入9倍體積的生理鹽水，用拍打式均質機均質。采用梯度稀釋法對樣品進行稀釋至在平板上菌落數在30個～300個范圍內便于計數。計數取3個數量級，每個數量級取3組平行[14]。吸取250 μL至平板涂布，將平板倒置于37℃恒溫培養箱中培養24 h～48 h，取出計數。

1.3.11 數據分析

試驗數據和圖形處理分析采用Excel和Origin 9.0軟件，試驗數據差異性分析采用SPSS 17.0軟件中的Duncan法評價。

2 結果與討論

2.1 新鮮魚糜制品中微生物菌相分析

對冷藏期間的魚糜制品進行菌相分析，分析在貯藏期12 d內，魚糜制品菌相變化。試驗采用宏基因組測序對魚糜制品進行分析。具體測序結果如圖1所示。

圖1 魚糜制品冷藏過程中不同科微生物占比Fig.1 The proportion of different microbes in the cold storage of surimi products

通過宏基因組對魚糜制品中微生物進行菌屬鑒定，結果顯示，在魚糜制品中主要存在的微生物為希瓦氏菌（Shewanellaceae），氣單胞菌（Aeromonadaceae），芽孢桿菌（Bacillaceae），莫拉菌（Moraxellaceae）和假單胞菌（Pseudomonadaceae）。腐敗希瓦氏菌是低溫貯藏魚類制品的腐敗微生物之一，會產生難聞的氣味，在較高溫度下即可抑制或殺死腐敗希瓦氏菌[15]。魚糜制品普遍采用二段式加熱方式進行凝膠熟化，溫度最高可達90℃～100℃，且持續時間較長，因此經熟化的魚糜制品中腐敗希瓦氏菌較少，圖1中腐敗希瓦氏菌含量基本穩定在2%～3%，數量較少，在貯藏后期出現明顯增加。氣單胞菌是淡水養殖中細菌性出血病的重要病原體之一，廣泛存在于河流、海水等水生環境中[16]。氣單胞菌最適生長范圍為30℃，但在0℃～40℃均可生長。圖1中，氣單胞菌在貯藏前期所占比重基本不變但是在貯藏后期，氣單胞菌的比重明顯增加，說明魚糜制品在熟化處理過后部分氣單胞菌被殺死，但仍然有氣單胞菌存活。莫拉菌是一種呈現桿狀或者球狀的革蘭氏陰性菌，最適生長溫度為33℃～35℃[17]。圖1中，莫拉菌在冷藏過程中所占比例明顯呈現下降趨勢，表明在經過高溫熟化后，且在4℃冷藏條件下，莫拉菌被殺死或受到抑制。

假單胞菌屬革蘭氏陰性桿菌，不形成芽孢，對有機物質如蛋白質有極強的分解能力，并以此為能量來源。因此，假單胞菌常見于魚類等高蛋白制品中，且為優勢腐敗菌群[18]。如圖1所示，在魚糜凝膠制品中，假單胞菌為優勢菌群，菌數量占比36%。但是在冷藏過程中，假單胞菌的比例急劇下降，在貯藏后期已不再是優勢菌群。假單胞菌是一種不產生芽孢的非耐熱菌種，因而在經過高溫蒸煮后，假單胞菌活菌數量急劇下降。

芽孢桿菌是一種能夠形成芽孢的桿菌或球菌，對外界因子抵抗性較強，耐高溫能在較高溫度下存活。芽孢桿菌在食品中能產生毒素，從而造成腹瀉、嘔吐等不良癥狀[19]。芽孢桿菌有一定的抑菌作用，能產生有抑菌效果的產物。由于芽孢的存在，高溫蒸煮并不能殺死魚糜制品中的芽孢菌，且在冷藏過程中，芽孢菌仍然緩慢的生長。圖1中可以明顯看出在冷藏貯藏期間，芽孢桿菌的比重大幅上升，在貯藏期中后期就成為優勢菌群。表1為魚糜制品中優勢菌群在冷藏過程中的數量占比。在冷藏的12天內，貯藏前期假單胞菌和莫拉菌所占比重較多，但是在貯藏中后期，芽孢菌比重明顯上升，貯藏期間芽孢菌比重增加120%。假單胞和莫拉菌在貯藏前期雖然比重較大，但多數為死菌，活菌數量較少。芽孢菌在貯藏前期活菌數量較多，因此冷藏過程中持續生長成為優勢菌種，且芽孢桿菌具有一定的抑菌作用，抑制了其他菌群的生長。

表1 冷藏期間魚糜制品中優勢菌占比Table 1 The proportion of dominant bacteria in surimi products during cold storage %

2.2 聚賴氨酸的抑菌效果

新鮮魚糜制品在冷藏過程中，微生物構成發生了變化。主要優勢菌從貯藏前期的假單胞菌到后期的芽孢菌。假單胞菌是在魚糜制品中常見的腐敗菌，具有極強的分解蛋白質能力，因此會導致魚糜制品在冷藏過程中的蛋白質降解，從而影響魚糜制品品質和風味[20]。大腸桿菌屬腸桿菌科、埃希氏菌屬，革蘭氏陰性菌[21]。大腸桿菌是一種病原菌，各國家對食品中大腸桿菌數量都有嚴格的數量控制，由于大腸桿菌分布廣，生存能力強，所以在工業生產中食品產品易受到大腸桿菌的污染。聚賴氨酸是一種具有廣譜抑菌效果的抑菌劑，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌都具有較強的抑菌能力。

表2為聚賴氨酸對魚糜制品中分離純化出的假單胞菌和芽孢桿菌以及工業生產中要嚴格控制的大腸桿菌的最小抑菌濃度。

表2 聚賴氨酸對優勢菌及大腸桿菌的最小抑菌濃度Table 2 MIC of poly-lysine to dominant bacteria and Escherichia coli

由表2可知，聚賴氨酸對大腸桿菌、假單胞菌以及芽孢菌均具有良好的抑菌效果。其中對大腸桿菌抑菌效果最佳，最小抑菌濃度為30 μg/mL。對革蘭氏陽性菌的芽孢桿菌也有一定的抑菌效果，最小抑菌濃度為60 μg/mL。因此，向魚糜制品中加入一定量的聚賴氨酸能有效的抑制魚糜制品中優勢菌和腐敗菌的生長。

2.3 聚賴氨酸對魚糜制品的抑菌效果

低溫冷藏魚糜制品，微生物的污染與代謝是導致魚糜凝膠劣化的主要因素之一。同時菌落總數是食品品質指標之一，關乎到食品安全以及食品貨架期。試驗添加不同劑量的聚賴氨酸，4℃冷藏12 d測得魚糜制品中菌落總數具體試驗結果如圖2所示。

圖2 不同聚賴氨酸添加量在冷藏過程中魚糜制品的菌落總數Fig.2 Total number of colonies of surimi products with different contents of poly-lysine during cold storage

圖2中，與空白對照組相比，添加聚賴氨酸能明顯抑制魚糜制品在冷藏期間微生物的數量，且聚賴氨酸添加量越高，對微生物抑制效果越顯著。魚糜制品中，微生物菌相構成在冷藏過程中有變化，主要優勢菌也發生改變，但是由于聚賴氨酸具有廣譜的抑菌效果，對魚糜制品貯藏前后期的優勢菌假單胞菌和芽孢菌均有良好的抑菌效果，因此聚賴氨酸能夠有效的抑制魚糜制品冷藏過程中微生物的生長，降低由于微生物導致的品質劣化。

2.4 多聚賴氨酸對魚糜制品凝膠強度的影響

魚糜制品相對于其他肉糜類產品，具有更高的凝膠強度，因此凝膠強度是衡量魚糜制品品質的重要指標，能夠表征魚糜制品在咀嚼時的口感。魚糜制品是一種高蛋白產品，凝膠強度主要來自于蛋白質的凝膠性。在高溫蒸煮過程中蛋白質出現熱變形，形成有序的網狀結構從而使得魚糜產品具有較高的凝膠強度。凝膠強度越高說明魚糜制品品質越高[22]。試驗向魚糜制品中加入不同添加量的聚賴氨酸，不同聚賴氨酸添加量對凝膠強度的影響見圖3。

由圖3可知，向魚糜制品中加入聚賴氨酸能夠小幅提升魚糜凝膠制品的凝膠強度，但顯著性分析表明不同聚賴氨酸添加量的魚糜制品凝膠強度差異不顯著。說明，聚賴氨酸魚糜凝膠制品不能明顯提升產品凝膠強度，不會對凝膠制品品質造成損害。

2.5 多聚賴氨酸對魚糜制品持水性和白度的影響

魚糜凝膠制品的持水性是指魚糜制品將水分保留其微觀結構中的能力，魚糜凝膠制品凝膠網絡越致密，離心后水分越不易流失，凝膠品質越好，是魚糜制品品質的重要衡量指標。試驗魚糜制品中加入不同添加量的聚賴氨酸，測量魚糜制品的持水性以及白度。不同聚賴氨酸添加量對魚糜制品持水性和白度的影響見圖4和圖5。

圖3 不同聚賴氨酸添加量的魚糜制品的凝膠強度Fig.3 Gel strength of surimi products with different contents of poly-lysine

圖4 不同聚賴氨酸添加量的魚糜制品的持水性Fig.4 Water holding property of surimi products with different contents of poly-lysine

圖5 不同聚賴氨酸添加量的魚糜制品的白度Fig.5 Whiteness of surimi products with different contents of poly-lysine

試驗表明，不同聚賴氨酸添加量的魚腸樣品持水性差異較小，但高濃度的聚賴氨酸會降低魚糜制品持水性。

由圖5表明，由于聚賴氨酸具有本身是一種淡黃色粉末，因此高添加量的聚賴氨酸會降低魚糜制品的白度，低添加量不影響魚糜制品白度。

3 結論

本試驗通過宏基因組學，研究魚糜制品在冷藏過程中微生物的菌相變化，比較冷藏前后期優勢菌的變化。通過添加聚賴氨酸，抑制魚糜制品冷藏過程中的優勢菌生長，從而降低由于微生物導致的品質劣化。結果表明：魚糜制品在冷藏過程中優勢菌由前期的假單胞菌到貯藏后期的芽孢菌，且多數非耐熱腐敗菌經由高溫蒸煮殺菌。聚賴氨酸對魚糜制品冷藏過程中的兩種優勢菌有明顯的抑菌效果，聚賴氨酸不會對魚糜制品品質造成明顯的不利影響，且最佳的聚賴氨酸添加量為0.1%。綜上所述，聚賴氨酸是一種能有效降低魚糜制品在冷藏過程中的品質劣化，適合在魚糜制品工業化生產中推廣使用。