燈盞花素對低氧誘導(dǎo)的大鼠肺泡炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)沉積的作用*

張旭 魏華華 謝敏 王永生

(1.成都市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 成都610041；2.成都市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 成都610031；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都610041)

氧氣是機(jī)體生長發(fā)育過程中不可或缺的因子，在物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)化及機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著重要作用；氧氣濃度可嚴(yán)重影響組織細(xì)胞增殖、分化及功能維持。大量研究表明，低氧可以誘導(dǎo)肺泡上皮損傷[1-2]，肺泡炎癥反應(yīng)[3]，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖[4]及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[5]，并通過誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)[6-7]、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)[8-9]、結(jié)締組織生長因子(CTGF)[10]等致纖維化因子的表達(dá)量增高，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成及沉積[11]，甚至肺間質(zhì)纖維化的形成[8,12-13]。燈盞花素具有舒張血管、抗凝、抗炎、降脂、清除氧自由基等作用，并可減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[14]。本實驗主要觀察間斷性低氧對大鼠肺泡結(jié)構(gòu)的影響及燈盞花素對其干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SPF級SD大鼠80只，體重200～250g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供。兔抗大鼠TGF-β1及兔抗大鼠Ⅰ型膠原多克隆抗體購于美國 Santa Cruz，兔抗大鼠Smad4(CST公司)，羊抗兔β-actin抗體(北京博奧森)，發(fā)光顯跡液(美國Milipore)，鼠TNF-a Elisa試劑盒(深圳達(dá)科為)，TaKaRa RNA RT-PCR試劑盒(寶生物有限公司)，引物設(shè)計合成(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及標(biāo)本采集 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠80只平均分為對照組：清潔環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)，未予任何處理；單純低氧組：每天置于低壓氧艙8h，用氮?dú)饩S持氧艙內(nèi)壓力為101kPa，O2濃度為10%，其余時間飼養(yǎng)環(huán)境同對照組；低氧+低劑量燈盞花素組：每天低氧處理前半小時按10mg/kg腹腔注射燈盞花素，余處理同單純低氧組；低氧+高劑量燈盞花素組：每天低氧處理前半小時按40mg/kg腹腔注射燈盞花素，余處理同單純低氧組。分別于第3、7、14、21d，每組隨機(jī)抽取5只大鼠，予3 % 戊巴比妥鈉(50/mg/kg)腹腔注射麻醉后，股動脈放血處死，解剖分離主支氣管及雙肺，止血鉗夾閉右側(cè)支氣管，向左肺注入4℃預(yù)冷生理鹽水1ml，后緩慢回抽，共行三次，回收率約90%，后于4℃，3000r/min離心5min后取上清，取右肺中葉固定于10%的中性甲醛48h后石蠟包埋，并行HE及免疫組化染色，剩余雙肺肺葉均投入液氮迅速凍存，后將肺泡灌洗液(BALF)上清液及肺組織標(biāo)本均保存于-80℃冰箱。

1.2.2 免疫組化法(SABC法)檢測肺組織中TGF-β1、I型膠原的表達(dá) 將肺組織標(biāo)本常規(guī)脫蠟、水化、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；抗原修復(fù)；5% BSA封閉; 一抗 (兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體1∶300；兔抗大鼠 I 型膠原多克隆抗體1∶150；二抗：試劑 SABC；DAB顯色；常規(guī)蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片。免疫組化染色結(jié)果采用電腦圖像采圖軟件 NIKON& Spot 彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集, 以圖文分析軟件Image-Pro plus 5.0(美國)分析肺組織免疫組化圖像, 將肺組織各時點(diǎn)切片每張隨機(jī)取染色區(qū)域 5個高倍視野(×400) , 測量并記錄每個視野陽性染色的平均積分光密度值(IOD值)。

1.2.3 Western blot 法檢測肺組織中通道蛋白Smad4的表達(dá) 取適量右肺組織于液氮中研磨成粉后收集于1.5 ml EP管中，加入1ml含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，振動器充分混勻靜置30min后超聲破碎組織，4℃，12000r/min離心30min，提取上清液BCA法測蛋白濃度。加上樣緩沖液并于沸水中煮10min，后以120g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，10% BSA封閉2h，加一抗(1：800)4℃過夜，TBST洗膜5min/次×3次，加二抗(1：10000)室溫放置2h，再洗膜三次，加入ECL熒光劑，壓片顯影。ScanDrv6軟件掃描膠片，使用Quntity One圖像分析軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行分析。以Smad4與內(nèi)參β-actin的比值代表目的蛋白表達(dá)的相對含量。

1.2.4 RT-PCR 檢測TGF-β1、I型膠原蛋白的表達(dá) 液氮研磨組織成粉，加入1ml Trizol，并以Trizol法提取組織中總RNA，按TaKaRa試劑盒說明操作，完成逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增。總反應(yīng)體系為25μl，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃變性0.5min，54℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，反應(yīng)30個循環(huán)。15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并用凝膠成像儀行凝膠攝像及圖像分析。TGF-β1上游引物： 5'-GGC CAG ATC CTG TCC AAA CT-3' ，下游引物：5'-CAC GAT TAC CAC CTG GCG TT-3'；I型膠原上游引物： 5’-GAC TGG TGA GAC CTG CGT GTA-3’，下游引物：5’-GCC TCT TGT CCT TGG GGT T-3’；β-actin上游引物：5’-CCT CAT GAA GAT CCT GAC CG-3’,下游引物：5’-ACC GCT CAT TGC CGA TAG TG-3’。 以TGF-β1 與β-actin電泳條帶積分光密度(IOD)值的比值表示TGF-β1、I型膠原的相對表達(dá)量。

1.2.5 ELISA測定BALF中TNF-α的表達(dá) 取適量肺泡灌洗液上清，震蕩混勻后，按ELISA試劑盒說明分別測定TNF-α水平。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)改變

2.1.1 肉眼觀察 對照組大鼠肺組織呈均勻的粉紅色，表面光滑亮澤,質(zhì)地柔軟,彈性良好；單純低氧組大鼠肺組織顏色暗紅，組織腫脹，彈性降低，質(zhì)韌，隨時間的推移，雙肺顏色加深，體積增大；低氧+高劑量燈盞花素組大鼠肺組織顏色及腫脹程度均較單純低氧組輕。

2.1.2 組織形態(tài)學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示，對照組肺組織結(jié)構(gòu)未見明顯充血水腫及炎癥反應(yīng)，單純低氧組大鼠第3d即出現(xiàn)輕度的組織水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，7d時肺組織血管充血、水腫明顯,肺間質(zhì)出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤，14、21d炎癥狀逐漸加重，肺泡間隔明顯增寬；與低氧組相比，各藥物干預(yù)組在第21天肺組織水腫、炎癥反應(yīng)及肺泡間隔增厚程度均較輕，見圖1、2。

圖1 對照組與各時點(diǎn)單純低氧組肺組織病理學(xué)改變(HE×100)Figure 1 The pulmonary pathological changes of group A and group B at different time points注：A.對照組；B～E：單純低氧組第3、7、14、21d

圖2 第21天各組肺組織病理學(xué)改變(HE×100)Figure 2 The pulmonary pathological changes in each group at the 21st d注：A～D 分別為對照、單純低氧、低氧+低劑量燈盞花素、低氧+高劑量燈盞花素組

2.2 不同時間低氧對肺組織中TGF-β1、I型膠原的表達(dá)的影響 TGF-β1、I 型膠原在常氧情況下大鼠肺組織中有基礎(chǔ)量表達(dá)(黃染區(qū)為目的蛋白陽性表達(dá)區(qū))，TGF-β1為胞漿染色, I 型膠原為間質(zhì)及胞漿染色。低氧組TGF-β1、I 型膠原表達(dá)都明顯增加,低氧處理第3d后TGF-β1、I型膠原的表達(dá)量即開始升高(P<0.01)，并隨低氧時間的延長而升高，見圖3～6，表1。

圖3 對照組與單純低氧組各時點(diǎn)肺組織中TGF-β1的表達(dá)(SABC ×400)Figure 3 The expression of TGF-β1 in group A at different time points注：A.對照組；B～E 分別為單純低氧組第3、7、14、21d

圖4 對照組與單純低氧組各時點(diǎn)肺組織中I型膠原的表達(dá)(SABC ×400)Figure 4 The expression of TGF-β1 in group A at different time points注：A：對照組；B～E 分別為單純低氧組第3、7、14、21d

圖5 第21天各組肺組織中TGF-β1的表達(dá)(SABC ×400)Figure 5 The expression of TGF-β1 in each group at the 21st day注：A～D 分別為對照、單純低氧、低氧+低劑量燈盞花素、低氧+高劑量燈盞花素組

圖6 第21天各組肺組織中I型膠原的表達(dá)(SABC ×400)Figure 6 The expression of COL I in each group at the 21st day注：A～D 分別為對照、單純低氧、低氧+低劑量燈盞花素、低氧+高劑量燈盞花素組

時間Collagen ITGF-β1對照組單純低氧組對照組單純低氧組3d14.32±0.8625.35±1.21①10.53±1.4117.63±1.048①7d14.98±0.9232.52±2.54①②9.92±1.0620.07±1.77①②14d15.32±1.6836.55±2.75 ①②③10.25±1.4625.96±1.46①②③21d15.67±1.7242.96±6.25①②③④10.09±1.1330.80±1.22①②③④

注： 與對照組比較，①P<0.01；與低氧組3d比較，②P<0.05；與低氧組7d比較，③P<0.01；與低氧組14d比較，④P<0.01

2.3 低氧對肺組織中Smad4蛋白表達(dá)及BALF中TNF-α含量的影響 Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，低氧組各時點(diǎn)Smad4蛋白表達(dá)均較常氧組升高，且隨低氧時間的延長Smad4的表達(dá)進(jìn)行性升高，相關(guān)性分析顯示Smad4蛋白的表達(dá)水平與TGF-β1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.944，P<0.01)。ELISA法結(jié)果顯示大鼠BALF中含有微量TNF-α表達(dá)，低氧處理3d后TNF-α開始升高(P<0.05)，并于第7d達(dá)高峰，此后TNF-α濃度稍有降低并趨于穩(wěn)定，但較第3d仍升高(P<0.01)，見圖7，表2。

圖 7 Western blot檢測各組各時點(diǎn)Smad4的表達(dá)Figure 7 Western blot analysis of expression of Smad4 at different time points of hypoxia注：1～4分別為對照組第3、7、14、21d Smad4表達(dá)量；5～8分別為單純低氧組第3、7、14、21d Smad4 表達(dá)量

時間Smad4TNF-α對照組單純低氧組對照組單純低氧組3d8.81±0.4712.27±0.84①34.32±2.3062.18±6.86①7d8.91±0.6515.24±0.57①②40.55±4.64108.72±11.84①②14d9.43±1.7319.46±1.79①②③46.90±8.3287.34±7.94①②21d9.41±0.7823.24±1.25①②③④53.40±8.5285.04±3.33①②

注：與對照組比較，①P<0.01；與低氧組3d比較，②P<0.05；與低氧組7d比較，③P<0.01；與低氧組14d比較，④P<0.01

2.4 低氧對各時點(diǎn)肺組織中TGF-β1、I型膠原mRNA表達(dá)的影響 低氧組各時點(diǎn)TGF-β1及I型膠原的mRNA表達(dá)量較空白對照組均有所上調(diào)(P<0.05)，以第21d最為顯著，見圖8，表3。

圖8 RT-PCR檢測單純低氧組各時點(diǎn)TGF-β1及I型膠原的表達(dá)Figure 8 Detection of TGF-β1 and collagen I mRNA with RT-PCR 注： 1～4分別為對照組第3、7、14、21d；5～8分別為單純低氧組第3、7、14、21d

時間TGF-β1Collagen I對照組單純低氧組對照組單純低氧組3d0.81±0.0881.208±0.100①0.681±0.0490.997±0.087①7d0.793±0.191.433±0.085①②0.686±0.0521.202±0.124①②14d0.933±0.0671.781±0.071①②③0.705±0.0331.423±0.068①②③21d0.840±0.0561.882±0.053①②③0.738±0.0351.708±0.062①②③④

注：與對照組比較，①P<0.05；與低氧3 d比較，②P<0.05；與低氧7d比較，③P<0.05；與低氧14d比較，④P<0.05

2.5 第21天各組大鼠肺組織中TGF-β1及Col I蛋白及mRNA的表達(dá) 試驗第21天單純低氧組大鼠肺組織中TGF-β1及Col I蛋白及mRNA表達(dá)量較對照組均顯著增加(P<0.01)；給予燈盞花素處理后，各組間TGF-β1 mRNA的表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異，但在蛋白水平，藥物干預(yù)組較單純低氧組TGF-β1的表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)，且不同藥物濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與TGF-β1相比，藥物干預(yù)組Col I蛋白及其mRNA表達(dá)水平均較單純低氧組低(P<0.05)，且高濃度抑制作用明顯(P<0.01)， 見表4，圖5、6、9。

表4 第21天各組肺組織中TGF-β1及Col I蛋白及mRNA的表達(dá)Table 4 The protein and mRNA expression of TGF-β1 and COL I in each group at the 21st day

注：與對照組比較，①P<0.01；與低氧+高劑量燈盞花素組比較，②P<0.05；與低氧+低劑量燈盞花素組比較，③P<0.05

圖9 RT-PCR檢測第21天各組TGF-β1及I型膠原mRNA的表達(dá)Figure 9 Detection of TGF-β1 and collagen I mRNA with RT-PCR at 21st day in each group注：1～4為第21天對照、單純低氧、低氧+高劑量燈盞花素、低氧+高劑量燈盞花素組

2.6 第21天各組大鼠肺組織中Smad4蛋白及BALF中TNF-α的表達(dá) 單純低氧、低氧+低劑量燈盞花素、低氧+高劑量燈盞花素三組Smad4蛋白的表達(dá)量均較對照組增加(P<0.01)；但經(jīng)藥物干預(yù)后，低氧+低劑量燈盞花素、低氧+高劑量燈盞花素組較單純低氧組Smad4的表達(dá)水平有所降低(P<0.05)，且低氧+高劑量燈盞花素組較低氧+低劑量燈盞花素組降低(P<0.05)，見圖10，表5。

表5第21天各組肺組織中Smad4及BALF中TNF-α的表達(dá)

Table5TheexpressionofSmad4inlungtissue,andTNF-αinBALFatthe21stdineachgroup

組別Smad4TNF-α對照組12.74±3.5553.32±2.34單純低氧組26.92±2.75①②③84.89±1.86①②③低氧+低劑量燈盞花素組21.35±2.53①80.57±2.80①②低氧+高劑量燈盞花素組19.44±1.60①76.98±2.20①

注：與對照組比較，①P<0.01；與低氧+高劑量燈盞花素組比較，②P<0.05；與低氧+低劑量燈盞花素組比較，③P<0.05

圖10 Western blot檢測第21天各組Smad4蛋白表達(dá)Figure 10 Western blot analysis of expression of Smad4 at 21st day of hypoxia in each group.注：1～ 4分別為第21天對照、單純低氧、低氧+低劑量燈盞花素、低氧+高劑量燈盞花素組

3 討論

低氧可致組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤、上調(diào)致纖維化相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)、促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并增加細(xì)胞外基質(zhì)沉積 ，具有致纖維化作用。我們課題組前期體外試驗也證實低氧可以促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖，并通過激活三磷酸肌醇激酶/蛋白激酶(PI3K/ATK)、p38絲裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)信號通路促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成[4]。研究表明其具有舒張血管、抗凝、抗炎、降脂、清除氧自由基[15]等作用，并可減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，在心血管疾病中已得到廣泛應(yīng)用。本實驗主要觀察間斷性低氧對大鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響及燈盞花素對其干預(yù)作用，并探討其可能機(jī)制。

Madjdpour等[3]研究表明降低肺泡中氧濃度將導(dǎo)致大鼠肺組織明顯炎癥反應(yīng)，并使肺泡灌洗液中TNF-α的表達(dá)量上調(diào)。 Rassler 等[8]的研究也表明，持續(xù)性低氧可引起肺組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤及肺泡間隔增厚,甚至出現(xiàn)輕度間質(zhì)纖維化表現(xiàn)。本實驗結(jié)果表明，間斷低氧處理第3d起，大鼠肺組織即出現(xiàn)輕度水腫，隨低氧時間的延長逐漸出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡間隔的增厚。ELISA法檢測BALF中TNF-α也顯示低氧處理后TNF-α的表達(dá)量逐漸升高，至第7d時達(dá)高峰，后稍有降低并趨于穩(wěn)定，但仍明顯高于對照組(P<0.01)；給予燈盞花素干預(yù)后，大鼠肺泡水腫、炎癥反應(yīng)、間隔增厚程度均較低氧組減輕，且BALF中TNF-α的表達(dá)量也降低。可能因低氧的方式不同及低氧時間不足，本試驗各組大鼠肺組織均未出現(xiàn)明顯纖維化改變。

TGF-β1具有趨化炎癥細(xì)胞、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化及細(xì)胞外基質(zhì)生成等生物學(xué)活性。而Smads通路是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路[16]，Smad4是 TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中必需的中轉(zhuǎn)分子。Rassler等[8]及Jiang 等[17]試驗均表明低氧可上調(diào)大鼠肺組織中TGF-β1的表達(dá)。本實驗結(jié)果說明低氧可以在蛋白及基因水平上調(diào)TGF-β1表達(dá)，并激活TGF-β1/Smads信號通路。藥物干預(yù)組結(jié)果顯示，TGF-β1及Smad4的蛋白表達(dá)較單純低氧組降低，但TGF-β1mRNA的量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。我們推測燈盞花素可能通過翻譯后調(diào)節(jié)影響TGF-β1蛋白的合成，進(jìn)而抑制TGF-β1下游信號通路。

Col I是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，受TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)節(jié)[18-19]。Sysa 等[20]通過siRNA干擾人肝臟星型細(xì)胞(LX-2)中SP1及Smad4基因的表達(dá)試驗也提示，TGF-β1可通過調(diào)節(jié)SP1及Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的作用上調(diào)Col I蛋白的表達(dá)。本試驗結(jié)果表明，單純組大鼠肺組織中TGF-β1及Col I在蛋白及mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，且TGF-β1的下游信號通路蛋白Smad4的表達(dá)水平也升高。故推論低氧通過TGF-β1/Smads信號通路上調(diào) Col I的表達(dá)，增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成。藥物干預(yù)組Col I蛋白及mRNA，TGF-β1蛋白、Smad4蛋白的表達(dá)量均較單純低氧組降低，且具有濃度依賴性，濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。故燈盞花素可能通過抑制TGF-β1/Smads信號通路抑制Col I的合成，預(yù)防肺間質(zhì)重構(gòu)。

4 結(jié)論

間歇性低氧可誘發(fā)大鼠肺組織炎癥反應(yīng)，上調(diào)TNF-α、TGF-β1及Smad4的表達(dá)，促進(jìn)Col I的合成及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，導(dǎo)致肺泡間隔增寬甚至組織重構(gòu)。而燈盞花素則可能通過抑制炎癥反應(yīng)，并通過翻譯后調(diào)節(jié)降低TGF-β1蛋白及Smad4蛋白的表達(dá)，抑制TGF-β1/Smads信號通路，從而抑制Col I的合成及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,保護(hù)肺功能。