全國中藥資源普查采集女貞子樣品農藥殘留研究

高巖,劉薇,熊慧，薛雪，劉夢楠，李向日*,魏鋒*

(1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488;2.中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所，北京 100050)

我國80%中藥材來源于人工栽培[1]，為了防治病蟲害，栽培過程中不可避免需要使用農藥，但其中部分藥材在栽培過程中不合理使用農藥，造成農藥殘留超標，給中藥臨床應用的安全性造成了巨大的隱患，同時也制約了中藥及相關產品的發展和推廣。

女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit. 的干燥成熟果實,具有滋補肝腎，明目烏發的功效[2]。其主要活性成分為萜類和苯乙醇苷類等有機類成分[3]與相關無機元素。其效果確切，臨床應用范圍廣，是多種中成藥和保健食品的原料藥。2013年第四次全國中藥資源普查項目發現女貞子分布區域廣、產地多，各產地自然氣候條件和采收加工差異等因素導致其質量參差不齊，質量控制和安全評價標準亟待進一步規范。對其質量控制研究較多，但對于女貞子農藥殘留相關研究較少[4]。因此，本實驗建立氣相色譜-串聯質譜法和液相色譜-串聯質譜法農殘測定方法，測定全國第四次中藥資源普查所收集的不同產地的48批女貞子樣品中的229種農藥殘留并根據《中國藥典》[2]女貞子項下含量測定的規定對其進行含量測定，為了解全國范圍內女貞子農藥殘留現狀及進一步指導女貞子栽培中農藥的合理使用提供數據支撐和科學依據。

1 材料

1.1 儀器

超高液相色譜串聯四級桿質譜儀(Waters，ACQUITY UPLC-Vex TQ-S MS)、十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(1.6 μm，2.1 mm×150 mm， CORTECSTM UPLC C18)、氣質聯用儀(Agilent 7890B/5977A GC/MSD)、彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,DB17ms)、Sartorius電子分析天平(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 試劑

禾草敵、環草丹、草達滅(編號：GBW(E)082601，濃度為100 μg·mL-1，北京壇墨質檢科技有限公司);異丙甲草胺(編號：GBW(E)082612，濃度為100 μg·mL-1，天津農業部);毒死蜱(編號：BW900808-100-N，濃度為100 μg·mL-1，北京壇墨質檢科技有限公司);三唑磷(編號：GBW(E)082340，濃度為100 μg·mL-1，北京壇墨質檢科技有限公司);三氟氯氰菊酯(編號：GSB05-2305-2016，濃度為100 μg·mL-1，天津農業部)乙腈(色譜級，美國Fisher公司);甲酸、甲酸銨樣品共批來源于第四次資源普查采集的女貞子48批藥材，經鑒定為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit的干燥成熟果實，其中安徽7批、四川3批、云南5批、湖南13批、山西8批、河南12批，樣品信息見表1。

2 實驗方法

應用氣相色譜-串聯質譜法和液相色譜-串聯質譜法[5]測定229種農藥種類，其中采用氣相色譜-串聯質譜法測定144種，液相色譜-串聯質譜法測定85種。

表1 樣品信息

2.1 對照品貯備液的制備

分別精密移取各農藥對照品貯備溶液適量，以丙酮為溶劑于100 mL棕色容量瓶中定容，混勻，作為混合對照品貯備溶液。

2.2 混合對照品工作溶液的制備

分別精密量取混合貯備液適量，加乙腈制成含各對照品為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng·mL-1不同濃度系列的混合對照品溶液，現用現配。

2.3 內標貯備溶液的配制

精密量取磷酸三苯酯溶液(100 μg·mL-1)5 mL，置500 mL棕色容量瓶中，以乙腈為溶劑定容至刻度，混勻，即得。

2.4 氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)分析用內標-分析保護劑的配制

精密稱取核糖酸內酯1.0 g，置50 mL棕色容量瓶中，以乙腈為溶劑溶解，定容至刻度(A液，20 mg·mL-1)；另精密稱取山梨醇0.50 g，置50 mL棕色容量瓶中，以乙腈：水(1:1)為溶劑溶解，定容至刻度(B液，10 mg·mL-1)。混合上述 A、B溶液，搖勻，精密加入上述內標貯備溶液5 mL，搖勻，即得(含磷酸三苯酯約50 ng·mL-1)。

2.5 液相色譜-串聯質譜法 (LC-MS/MS)分析用內標溶液的配制

精密量取上述內標貯備溶液5 mL，置100 mL棕色容量瓶中，以乙腈為溶劑定容至刻度，混勻，即得(含磷酸三苯酯約50 ng·mL-1)。

2.6 色譜分析條件

2.6.1 GC-MS/MS分析條件

色譜柱：彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,DB17ms)；載氣：高純氦氣，柱流速1.3 mL·min-1；進樣口溫度：240 ℃，高壓不分流進樣；進樣量：1 μL；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min，以30 ℃·min-1升至120 ℃，以10 ℃·min-1升至160℃，以2 ℃·min-1升至230 ℃，以15 ℃·min-1升至300 ℃，保持6 min，以20 ℃·min-1升至320 ℃，保持3 min。

電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃。

2.6.2 LC-MS/MS分析條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(1.6 μm，2.1 mm×150 mm， CORTECSTM UPLC C18)。

流動相：流動相 A為0.1%甲酸(含5 mmol·L-1甲酸銨)溶液，流動相 B為95 %乙腈溶液(含0.1%甲酸和5 mmol·L-1甲酸銨)，梯度洗脫為0～0.2 min，70%A；0.2～10 min，70%～0%A；10～12 min，0%A；12～13 min，0%～70%A；13～17 min，70%A。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣室溫度：10℃；進樣量：2 μL；離子源：電噴霧(ESI)，正離子模式；監測模式：多反應監測(MRM)；毛細管電壓：2.50 kV；錐孔電壓：30.00 V；離子源溫度：150 ℃；去溶劑溫度：550 ℃；錐孔氣：150 L·Hr-1；去溶劑氣：1 000 L·Hr-1；碰撞氣：0.14 mL·min-1；氣簾氣：138 kPa；碰撞氣：48 kPa。

2.7 供試品溶液的制備

2.7.1 供試品溶液的提取

精密稱定供試品粉末5.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入乙腈30 mL，室溫條件下超聲提取15 min，離心，取上清液，同法提取2次，合并上清液，40 ℃條件下減壓濃縮至近干，以乙腈為溶劑溶解，定容至10 mL棕色容量瓶中，渦旋混勻，即得。

2.7.2 供試品溶液的凈化

凈化1:移取2.7.1提取項下制備的溶液，以微孔濾膜濾過，精密移取2 mL，置于以乙腈：甲苯(3∶1)混合溶液10 mL預洗過的石墨碳黑固相萃取小柱(500 mg)，以20 mL乙腈：甲苯(3∶1)混合溶液進行洗脫，收集洗脫液，氮吹至干，以乙腈為溶劑溶解，定容至2 mL棕色容量瓶內，渦旋混勻，即得。凈化2：凈化1所得提取液2 mL，減壓濃縮至干，以環已烷：乙酸乙酯(1∶1)溶液為溶劑溶解，定容至5 mL棕色容量瓶中，渦旋混勻，以凝膠滲透色譜(GPC)凈化，進樣5 mL，(GPC主要參數：填料Bio-Beads S-X3 200～400目,凈化柱2.5 mm×40 cm，洗脫參數：pre run 940 s，main run 1200 s，tail run 300 s)，以環已烷：乙酸乙酯(1:1)為流動相洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至近干，乙腈溶解定容至2 mL棕色容量瓶中，供GC-MS/MS和LC-MS/MS分析。

2.8 測定

2.8.1 GC-MS/MS測定

精密量取混合對照品溶液、供試品溶液各2 mL，加GC- MS/ MS分析用內標-分析保護劑0.5 mL， 渦旋混勻，進樣，即得。

2.8.2 LC-MS/MS測定

精密量取混合對照品溶液、供試品溶液各2 mL，加GC- MS/ MS分析用內標-分析保護劑0.5 mL，渦旋混勻，進樣，即得。

2.8.3 空白基質校正法

對農藥殘留進行定量時以空白基質混合標準工作溶液。

2.8.4 空白試驗

除不稱取試樣外，按2.7.1至2.8.2上述步驟進行。

2.9 結果分析方法及定量計算方法

2.9.1 定性分析

若樣品中檢測出的色譜峰的保留時間與混合對照品儲備液中某種農藥的色譜峰相一致，且離子對的豐度符合表2要求，則可判定樣品中此種農藥檢出。

2.9.2 定量分析

采用內標法單離子定量計算，內標物為磷酸三苯酯，樣品中農藥殘留的峰面積均應在儀器檢測的線性范圍之內。

表2 樣品溶液中離子相對豐度的允許偏差范圍

2.9.3 實際樣品分析

應用所建立的實驗方法，測定樣品中的農藥種類，需同時滿足2.9.1定性分析和2.9.2定量分析的相關條件，才能確定為樣品中含有此種農藥殘留并對其定量。

3 結果與分析

3.1 線性范圍和定量限

用空白基質配制的混合標準溶液濃度，在1～1 000 ng·mL-1范圍內，所有農藥的線性相關系數均≥0.995。同時測定多種農藥殘留量時，以農藥在儀器上最低的響應值計算，農藥的檢出限為5倍信噪比(S·N-1)，定量限為10倍信噪比，得到該方法農藥的檢出限為0.1～1 ng·mL-1，定量限為0.2～2 ng·mL-1，檢出農殘標準曲線見表3。

表3 農藥標準曲線

3.2 精密度測定

取濃度為50.0 ng·mL-1的229種農藥混合標樣，按2.8測定項下條件，連續進樣6次，測定峰面積，峰面積結果相對標準偏差(RSD)均小于5%。

3.3 加樣回收率測定

精密稱定不含農藥殘留的供試樣品5.0 g，以2 μg添加水平進行回收試驗，計算229種農藥回收率，平行測定3次，平均回收率范圍為85.1%～103.2%，相對標準偏差(RSD)范圍為2.3%～5.1%。

3.4 農藥殘留測定結果

按照相應色譜條件對48批女貞子進行農藥殘留分析測定，其中僅5種農藥殘留被檢出 ,其余農藥均未檢出。禾草敵(環草丹/草達滅)在湖南發現2批，云南1批；異丙甲草胺在安徽發現1批；毒死蜱在安徽發現1批；三唑磷在山西發現1批；三氟氯氰菊酯在河南發現1批。除四川地區外，其余5省區均檢出含有農藥殘留的樣品，具體結果見表4。

表4 女貞子農藥殘留測定結果(mg·kg-1)

4 討論

針對女貞子中多種農藥所需要的檢測儀器及檢測條件不同，用2種儀器方(GC-MS/MS、HPLC-MS/MS)對229種農藥殘留進行了測定。全國范圍內的48批女貞子樣品中有7批檢測出農藥殘留，檢出農藥種類為禾草敵(環草丹/草達滅)3批、異丙甲草胺1批、毒死蜱1批、三唑磷1批、三氟氯氰菊酯1批，說明女貞子藥材栽培過程中農藥使用省份范圍較廣，農藥使用種類多樣，其中包含禁止在蔬菜上使用的毒死蜱和三唑磷。因此急需對女貞子藥材栽培中的農藥使用種類和殘留量進行規定。