黃芩藥材商品規格與內在質量相關性研究

劉婷，孔銘，劉麗芳，李松林*

(1.中國藥科大學天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009;2.江蘇省中醫藥研究院和中國中醫科學院江蘇分院中藥代謝組研究室，江蘇 南京 210028;3.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院中藥質量研究室，江蘇 南京 210028)

黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi (SBG)的干燥根，氣微，味苦，性寒；歸肺、膽、脾、大腸、小腸經；具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎的功效[1]，是臨床常用藥材?，F代藥理學研究表明，黃芩具有抗菌、抗炎、保護心腦血管等藥理作用[2-3]。黃芩主要含有黃酮類化學成分[4-7]，其中黃芩苷為主要成分，具有抗病毒、抗氧化和神經保護的作用。《中國藥典》(2015年版，一部)中以黃芩苷(≥9.0%)的質量分數作為評價黃芩藥材質量優劣的標準，此外黃芩中還含有漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、夏佛塔苷和芹菜素等黃酮類化學成分，它們也都具有一定的抗菌、抗病毒及解熱抗炎的功效。黃芩中還含有苯乙醇苷類化學成分，其中毛蕊花糖苷是黃芩中一種主要的苯乙醇苷類成分，具有抗炎、免疫調節的活性[8-9]。

黃芩主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河南、河北、山西、甘肅等地，其中河北、山西、內蒙古產量最大[10]?，F行的黃芩等級規格的劃分是依據1984年國家醫藥管理局和衛生部聯合頒布的《76種藥材商品規格標準》[11]，將黃芩分為條芩和枯芩兩種規格，條芩系指內部充實的新根、幼根，枯芩系指枯老腐朽的老根。其中，又根據條芩的長度與直徑將其細分為一等和二等兩種等級，一等條長10 cm以上，中部直徑1 cm以上；二等條長4 cm以上，中部直徑1 cm以下，但不小于0.4 cm[12]。然而，目前的等級標準僅以外觀性狀為指標，缺乏對藥材內在品質的描述，現有等級標準是否體現出黃芩藥材內在質量尚缺乏深入研究。本研究采集了三個產地的不同商品規格的條芩，采用創建的HPLC法同時測定黃芩中9種主要活性成分的含量[13-17]，通過與外觀性狀比較及聚類分析，探討黃芩中條芩商品規格與內在質量的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芩藥材采集于河北、山東、山西，由江蘇省中醫藥研究院李松林研究員鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi (SBG)的干燥根。藥材信息見表1。

對照品黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A購自中國食品藥品檢定研究院(質量分數≥98%，批號分別為110715-200514、071114、051222、080325);對照品黃芩素、白楊素、夏佛塔苷、芹菜素、毛蕊花糖苷購自四川省成都市維克奇生物科技有限公司(質量分數≥98%，批號分別為wkq16011504、wkq16032304、wkq16071404、wkq15122405、wkq16062004)；色譜級甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)；色譜級乙腈(美國天地有限公司)；超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

AT201十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒公司)；Waters2695高效液相色譜儀(美國Waters公司);Waters 2996、2489紫外檢測器(美國Waters公司)；KQ-500D型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Millipore Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)；粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；DK-S28型恒溫水浴鍋(上海精宏試驗設備有限公司)；Microfuge16臺式微量離心機，美國貝爾曼庫爾特有限公司。

2 結果與分析

2.1 藥材外觀性狀的測定

對河北、山東、山西3個不同產地，條芩一等、條芩二等2種不同規格，共18批黃芩藥材外觀性狀進行測定。每批隨機抽取56根藥材，分別用直尺測量其長度、直徑，并用電子秤稱取每根藥材重量，記錄藥材長度、直徑及重量的平均值。同時對藥材外觀進行拍照記錄。測定及拍照結果見表2及圖1。

圖1 黃芩藥材照片

產地等級編號河北一等JSPACM-65-1JSPACM-65-2JSPACM-65-3二等JSPACM-65-4JSPACM-65-5JSPACM-65-6山東一等JSPACM-65-7JSPACM-65-8JSPACM-65-9二等JSPACM-65-10JSPACM-65-11JSPACM-65-12山西一等JSPACM-65-13JSPACM-65-14JSPACM-65-15二等JSPACM-65-16JSPACM-65-17JSPACM-65-18

表2 黃芩藥材外觀性狀測定

本研究對不同產地(河北、山東、山西)一等和二等條芩藥材外觀性狀進行了測定，結果顯示不同產地(河北、山東、山西)的一等條芩藥材條長和中部直徑均大于二等，且一等條芩藥材重量顯著大于二等，其中山東一等條芩條長15.50 cm、中部直徑1.25 cm、根部重量為14.98 g，顯示為各項外觀指標最優的黃芩藥材。但不同產地之間的外觀比較有一定差異，如山東的二等條芩長度、直徑均大于河北的一等條芩。條芩藥材外觀性狀的測定結果與《76種中藥材商品規格標準》中對黃芩藥材商品規格的劃分標準基本一致，表明目前市場黃芩規格的劃分以外觀為主。

2.2 黃芩中9個主要活性成分的含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備

取黃芩藥材粉末0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲提取30 min，放冷。用70%乙醇補足減失重量，搖勻，吸取1 mL上清液，于13 000 r/min 離心10 min。即得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備

依次稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、夏佛塔苷、芹菜素和毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成混合對照品儲備液，使得對照液中的含量分別為999.44 μg/mL、269.92 μg/mL、59.95 μg/mL、10.26 μg/mL、7.99 μg/mL、4.10 μg/mL、4.10 μg/mL、4.11 μg/mL、5.59 μg/mL。

2.2.3 色譜條件

色譜柱為AltimaTMC18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫：0～20 min，10%～25%乙腈；20～35 min，25%～30%乙腈；35～40 min，30%～40%乙腈；40～50 min，40%～50%乙腈；50～60 min，50%乙腈；柱溫35 ℃；進樣體積10 μL；流速1.0 mL/min；檢測波長280 nm。

2.2.4 專屬性考察

精密吸取對照品和供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄60 min內的色譜圖。結果顯示，供試品液相色譜圖中能指認黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素和千層紙素A共6種黃酮類成分，分離良好。另外3種成分夏佛塔苷、芹菜素和毛蕊花糖苷無法指認?；旌蠈φ掌啡芤汉凸┰嚻啡芤荷V圖見圖3。

圖2 化合物結構圖1.黃芩苷;2.漢黃芩苷;3.黃芩素;4.漢黃芩素;5.白楊素;6.千層紙素A;7.夏佛塔苷;8.芹菜素;9.毛蕊花糖苷

2.2.5 線性關系考察

精密吸取混合對照品儲備液，加甲醇逐級稀釋成5個不同濃度的混合對照品溶液。在“2.2.3”項色譜條件下進樣分析，以對照品濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制峰面積與濃度之間的標準曲線，得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、夏佛塔苷、芹菜素和毛蕊花糖苷的回歸方程分別為Y=26 623X+165 348，R2=1.000 0、Y=28 027X+26 890，R2=0.999 9、Y=48 297X-96 525，R2=0.999 8、Y=36 185X+88 767，R2=0.995 6、Y=33 302X-1633，R2=0.998 7、Y=23 068X+6313，R2=0.984 1、Y=9977X-133，R2=0.999 9、Y=24 349X-3291，R2=0.998 2、Y=5231X-521，R2=1.000 0。結果表明，上述9種成分在62.47～994.44、16.87～269.92、3.75～59.95、0.64～10.26、0.50～7.99、0.26～4.10、0.26～4.10、0.26～4.11、0.35～5.59 μg/mL內線性關系良好。

圖3 高效液相色譜圖A-混合對照品;B-供試品(1-黃芩苷;2-漢黃芩苷;3-黃芩素;4-漢黃芩素;5-白楊素;6-千層紙素A;7-夏佛塔苷;8-毛蕊花糖苷;9-芹菜素)

2.2.6 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，連續進樣6次，記錄各組分色譜峰面積。結果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、夏佛塔苷、芹菜素、毛蕊花糖苷峰面積的RSD值分別為0.38%、0.55%、1.93%、0.83%、1.15%、0.91%、0.91%、1.19%和1.07%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗

取同一批供試品溶液(編號JSPACM-65-1)，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣分析，記錄各組分峰面積。結果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素和千層紙素A的RSD值分別為0.31%、0.29%、0.77%、0.48%、0.60%和1.99%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.2.8 重復性試驗

取同一批黃芩藥材粉末(編號JSPACM-65-1)，平行制備6份供試品溶液。在“2.2.3”項下進樣分析，記錄各組分峰面積。結果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素和千層紙素A質量分數的RSD值分別為0.87%、1.04%、1.54%、4.30%、1.28%和4.61%，表明該方法的重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗

取同一批已知含量的黃芩藥材粉末(編號JSPACM-65-1)9份，每份0.05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分為3組，按樣品中各指標成分量的50%、100%、150%分別加入一定量的對照品，用70%乙醇提取并稀釋至50 mL。在“2.2”項下進樣分析，計算各成分的加樣回收率。結果見表3，6個主要成分的加樣回收率結果均符合要求。

2.2.10 含量測定

取18批黃芩藥材粉末，按“2.1.1”項下方法制備，每批藥材平行實驗3次。在“2.2.3”項色譜條件下進樣分析，記錄色譜圖，計算藥材中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素和千層紙素A的含量，結果見圖4。由圖4可知，(1)不同產地條芩一等藥材比較：山西產黃芩的黃芩苷、白楊素、千層紙素A含量均最高，分別為18.57%、0.14%、0.21%；山東產黃芩的黃芩素、漢黃芩素含量最低，分別為0.43%、0.09%；而總含量山西產的黃芩最高。其中同樣一等的河北黃芩的黃芩苷含量比山西黃芩低14.11%，黃芩素含量低32.83%，白楊素和千層紙素A含量山西與山東存在明顯差異，山西比山東分別高3.1倍、2.1倍。(2)不同產地條芩二等藥材比較：河北產地的黃芩苷、漢黃芩苷含量最低，分別為16.73%、2.77%；山西產地的黃芩素、白楊素、千層紙素A含量最高，分別為1.08%、0.13%、0.18%；總含量山東產的黃芩最高。其中，河北和山東產黃芩的漢黃芩苷和漢黃芩素含量差異較大，漢黃芩苷含量河北是山東的1.2倍，漢黃芩素含量河北比山東高約1倍。(3)相同產地不同等級條芩藥材比較：其中河北和山東的黃芩苷含量均是二等藥材顯著高于一等藥材，其余各指標成分的含量一、二等之間未見明顯差異。從含量測定結果來看不同產地之間黃芩有效成分含量有一定差異，但各不同等級之間未見明顯差異，結果表明黃芩藥材各主要成分含量與黃芩商品規格劃分結果并不一致。

表3 加樣回收率試驗(n=3)

圖4 黃芩含量測定結果(n=3)

2.3 聚類分析

為了更為直觀的反映黃芩藥材商品規格與內在成分含量的相關性，采用SPSS Statistics 19分析軟件分別對不同產地(河北、山東、山西)一等和二等條芩藥材含量測定結果進行聚類分析，結果見圖5。聚類分析將不同產地(河北、山東、山西)一等和二等條芩藥材分為兩類，河北一等3批藥材、河北二等2批藥材、山東一等1批藥材共6批藥材被分為一類，其余12批藥材被分為一類。聚類分析結果與黃芩等級劃分結果并不一致，提示傳統的黃芩藥材商品規格劃分與其內在成分含量沒有相關性。

圖5 黃芩含量測定結果聚類分析(n=3)

2.4 相關性分析

為了進一步探究黃芩藥材商品規格與每個內在成分含量之間的關系，采用SPSS Statistics 19分析軟件分別對不同等級的18批黃芩藥材含量測定結果進行相關性分析。結果見表4。由相關性分析可知，黃芩藥材等級與黃芩苷含量的相關系數為0.637(0

表4 黃芩等級與6個成分含量的相關性分析

注：P<0.05，相關性顯著；P<0.01，相關性極顯著。

3 討論

黃芩藥材規格劃分的歷史由來已久。梁代陶弘景在《本草經集注》[18]中提出：“圓者名子芩，破者名宿草(枯芩)，其腹中皆爛，故名腐腸?！边@是首次將黃芩分為子芩和枯芩兩種類型。明代李時珍[19]進一步對子芩和枯芩進行了區分，提出“宿芩乃舊根，多中心空，外黃內黑；子芩乃新根，多內實”的觀點。其他中醫藥典籍中常記載有2種規格，即子芩(條芩)和宿芩(枯芩)，兩者由于生長年限不同，也有認為兩者是藥性不同，功能主治有差異。近年來隨著黃芩需求量的不斷增加和野生植物資源的日益枯竭，黃芩栽培品受到有關部門的重視，目前黃芩以栽培為主，野生較少[10,20]。栽培年限1～3年不等，野生生長期在3年以上。野生黃芩采集以3～4月為佳，栽培黃芩11月采集為佳。一般認為條芩色黃堅實者質優[10,21]，顏色偏綠者質量為差，外觀性狀是評價其質量優劣的重要標準。本研究相關性分析結果顯示，黃芩等級越高，黃芩苷和千層紙素A含量越低，與其他成分無相關。但整體的聚類分析結果顯示，黃芩等級與其內在質量不一致。黃芩中的代表性活性成分黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和白楊素等的含量與傳統等級標準均不相符，原有的等級標準僅能反映黃芩外觀的優劣，尚不能體現黃芩內在質量的好壞，產生這種現象的原因可能與黃芩產地、種植、加工方式的變化有關。此外，隨著黃芩在生產、流通的不斷變化及藥材實際規格的改變，原有的等級標準的合理性尚有待進一步驗證。建議開展以內在質量和臨床療效為依據的黃芩藥材分級研究，將藥材外觀性狀、內部化學組分和療效結合起來進行量化研究，完善黃芩藥材商品等級規范。