失眠動物模型HPA軸和表觀遺傳修飾的變化及交泰丸的干預作用

趙俊云,楊曉敏,胡秀華,曹,簡郭血驕,楊向竹,郭健

(北京中醫藥大學，北京100029)

失眠為睡眠障礙中最為常見的類型，其主要表現為入睡困難、早醒、睡眠質量低下和睡眠時間減少，繼而造成注意力下降、記憶力減退等生理學改變。長期失眠還將導致精神疾患以及嚴重慢病的發生。流行病學研究顯示，在一般人群中失眠的發生率約為27%，嚴重影響人群的生活質量，并增加了潛在的社會安全危害，成為重要的社會及醫學問題，深入了解失眠的發生機制和尋找適當有效的治療手段至關重要。下丘腦-垂體-腎上腺軸(The hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA axis)的過度活躍被認為是失眠產生的重要生理學基礎[1-2]。中醫基于整體觀對于失眠或稱不寐進行了證型分類，臨床上常運用方藥、針灸等進行辨證施治。本文選取對氯苯丙氨酸(Para-Chlorophenylalanine，PCPA)致失眠大鼠模型為研究對象，心腎不交型方藥交泰丸作為干預手段，通過觀察血清HPA軸激素促腎上腺皮質激素釋放因子(Corticotropin-Releasing Factor,CRF)、促腎上腺皮質激素(Adrenocorticotropic Hormone，ACTH)、皮質醇(cortisol)的水平評估HPA軸的活躍程度，通過觀察血清表觀遺傳修飾的主要酶DNA甲基轉移酶1[(DNA(cytosine-5-)-Methyltransferase 1，DNMT1]和組蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase，HDAC)活性以及血清乙酰化組蛋白H3(Acetyl-Histone H3)水平的變化，探討交泰丸干預失眠的生理學機制和表觀遺傳機制，為從整體觀闡明方藥的作用機理提供新的視角。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量(200±10)g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，SPF級，許可證號:SCXK(京)2015-0015。

1.1.2 藥物與試劑

黃連和肉桂飲片購自北京同仁堂藥店；PCPA購自Ark PharmLnc.(批號:AK-80383，純度>98%);Elisa檢測試劑盒均購自北京奇松生物科技有限公司。

1.1.3 實驗儀器

3K15高速冷凍離心機(美國Eppendorf公司)，Safire2酶標儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及動物模型建立

參考文獻[3]的方法，將48只雄性SD大鼠適應1周后隨機分正常組、模型組和交泰丸組。實驗第1天，模型組和交泰丸組按300 mg/kg一次性腹腔注射 PCPA建立失眠模型，正常組一次性腹腔注射等體積生理鹽水。實驗第3天，交泰丸組灌胃交泰丸(黃連30 g，肉桂3 g)水提液(5 g/kg)，1次/d，連續3 d，正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水。

1.2.2 血清檢測

實驗第6天，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，收集的血液樣品經4℃靜置1 h，4℃、3 500 rpm離心15 min，收集血清-20℃保存備用。血清按ELISA試劑盒說明進行各指標檢測。

1.2.3 數據統計

2 結果

2.1 交泰丸顯著降低失眠大鼠血清HPA軸激素水平

與正常組比較，模型組血清CRF、ACTH、Cortisol水平均上升，但差異無統計學意義;與模型組比較，交泰丸組血清CRF、ACTH、Cortisol水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結果見表1。

表1 血清HPA軸激素水平

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 交泰丸顯著降低失眠大鼠血清DNMT1活性

與正常組比較，模型組血清DNMT1活性顯著上升(P<0.01)；與模型組比較，交泰丸組血清DNMT1活性顯著下降(P<0.01)。與正常組比較，模型組血清HDAC活性下降，但差異無統計學意義；與模型組比較，交泰丸組血清HDAC活性下降，但差異無統計學意義。結果見表2。

表2 血清DNMT1和HDAC活性

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

2.3 交泰丸顯著降低失眠大鼠血清Acetyl-Histone H3水平

與正常組比較，模型組血清Acetyl-Histone H3水平上升，但差異無統計學意義；與模型組比較，交泰丸組血清Acetyl-Histone H3水平顯著下降(P<0.01)。結果見表3。

表3 血清Acetyl-Histone H3水平

注：與模型組比較，**P<0.01

3 討論

HPA軸是機體維持內穩態和調控應激反應的重要生理學基礎。失眠過程中表現的生理上的過度興奮一部分會體現為HPA軸的過度活躍。由下丘腦分泌的CRF是機體調節應激反應的關鍵因子，其分泌異常與多種精神疾病的發生發展有關。CRF可直接作用于腺垂體的促腎上腺皮質激素分泌細胞，可促進ACTH的分泌。ACTH可促進腎上腺皮質的組織增生以及皮質激素(Cortisol)的生成和分泌。當皮質激素的分泌水平過高時，將反過來影響垂體和下丘腦，減弱其分泌活動，因此，在皮質激素的負反饋調節機制下，HPA軸保持相對的平衡和穩態，對于調節睡眠-覺醒的節律性具有重要意義[1-2]。HPA軸激素在臨床上已作為失眠及其他精神疾患診斷和治療的重要標志物。本研究中，模型組的HPA軸較正常組稍顯活躍，基本符合臨床上失眠患者的激素水平的變化趨勢，交泰丸干預3天后即可見失眠大鼠HPA 軸活躍度顯著下降，說明交泰丸可通過調節HPA軸的功能來發揮治療失眠的效果。同時，交泰丸的HPA軸調節作用從一定程度上為PCPA致失眠大鼠的心腎不交證型提供了證據，也為探討心腎相關理論提供了實驗依據。

表觀遺傳學已逐漸發展成為解讀疾病的重要手段之一，相比較傳統的分子生物學和基因組學，表觀遺傳學可從更宏觀的層次對疾病的發生發展以及藥物作用機制進行探討，這與中醫整體觀的核心思想相契合。表觀遺傳學的范疇相當廣泛，本文選取最為經典的DNA甲基化和組蛋白乙酰化修飾入手，嘗試對證候和方藥的表觀遺傳基礎進行探討。

DNA甲基化是最早發現的表觀遺傳修飾途徑，在DNA甲基轉移酶(主要是DNMT1)的作用下，目的DNA被甲基化修飾，從而改變DNA的構象和穩定性，進而改變DNA與蛋白質的相互作用方式，最終引起染色質結構的變化，從而引起染色質片段內大量基因功能的改變。因此，其效應可能涉及多個方面[4-5]。本文中，模型組血清DNMT1活性較正常組顯著上升，說明模型組動物DNA甲基化水平相對升高，提示由于部分基因的表達受到了抑制，導致機體內穩態的破壞，無法正常應答外部刺激。交泰丸干預可以調節DNMT1活性，重新活化受抑制的基因，使機體恢復內穩態。

組蛋白修飾也是表觀遺傳修飾的重要途徑之一。盡管不同種屬的組蛋白是高度保守的，但組蛋白可在相關酶的作用下發生乙酰化、磷酸化、甲基化等修飾，進而對其結合的DNA片段上的基因功能產生影響。組蛋白乙酰化是發現最早，研究最多的組蛋白修飾過程，目前對組蛋白H3的賴氨酸乙酰化研究的最為清楚。組蛋白的乙酰化水平由組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase,HAT)和HDAC的活性共同決定。當HDAC結合到特定的啟動子區，該區域組蛋白去乙酰化將導致基因轉錄的抑制[6-8]。本文中，模型組和交泰丸組血清HDAC活性均無顯著變化，但模型組血清Acetyl histone H3水平較正常組有所上升，說明部分基因可能由于組蛋白H3的乙酰化而被激活，同樣導致機體內穩態的破壞，也提示HAT與HDAC之間的平衡被破壞。交泰丸干預可能通過扭轉HAT和HDAC的不平衡狀態，使Acetyl histone H3水平下降，恢復部分基因的抑制狀態。

通過本研究，可以確定的是方藥對于機體表觀遺傳調控的可能性，通過DNA去甲基化修飾激活部分基因，同時通過組蛋白乙酰化修飾抑制部分基因，這樣的調控機制非常符合中醫藥的整體觀[9]。此外，本研究中還存在一些問題，如檢測手段單一、檢測指標不全、動物只選取了一種性別以及沒有相關行為學評價等，將在后續研究中進行完善。基于本文探討的心腎不交證型及方藥，還將繼續廣泛深入探討心腎相關理論的表觀遺傳機制，并可從表觀遺傳學角度探究證的發生與發展機制以及方藥的藥理作用機制，為中醫藥理論的現代研究開辟新的思路[10]。