安徽不同產地芝麻中木酚素和總酚含量及芝麻提取物抗氧化能力比較

朱秀靈，戴清源，木朝麗，蔡為榮，郭玉寶，許祚文，張志祥，汪建飛（.安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖 4000；.蕪湖益然香木榨食用油有限公司，安徽蕪湖 400）

0 引言

芝麻（Sesamum indicum L.）是最古老的油料作物之一，富含油脂（50%以上）、蛋白質（約25%）及抗氧化物質，如芝麻素、芝麻林素、生育酚等。除被用于生產芝麻油外，也廣泛用于糖果糕點、焙烤食品，在醫藥領域也有潛在的應用前景[1-2]。

長期以來，芝麻深受消費者青睞與其對人體的營養健康作用密不可分。芝麻木酚素是芝麻中最有營養價值的成分之一，具有促進乙醇代謝、肝解毒、調節血脂、降血壓、抗氧化及抗癌等生理活性[3-4]。因此，高含量的芝麻木酚素通常被作為芝麻品種選育的指標之一。芝麻木酚素包括脂溶性的芝麻素、芝麻林素及水溶性的芝麻素酚三糖苷、二糖苷、單糖苷等，其中以芝麻素（0.67～12.76 mg/g）、芝麻林素（0.20～6.96 mg/g）、芝麻素酚三糖苷 （0.68～6.40 mg/g）含量居高[4-8]。芝麻木酚素含量因地區、品種、顏色等因素的影響而有很大差異[8]。此外，芝麻中天然存在的木酚素及酚類物質是否與芝麻抗氧化能力相關，近年來也引起眾多學者的廣泛關注。研究發現，黑芝麻抗氧化能力強于白芝麻，但是抗氧化能力的強弱與芝麻素、芝麻林素含量之間沒有相關性[2，9]；芝麻素在體外的抗氧化能力較弱，但芝麻素的存在增強了γ-生育酚的抗氧化活性[10]；芝麻抗氧化活性與芝麻中酚類物質可能有一定的關系[11]。芝麻抗氧化能力與芝麻木酚素含量及總酚含量是否相關尚需進一步研究。

我國是芝麻生產及消費大國，安徽省是芝麻種植面積較大的省份之一，芝麻種植面積和產量僅次于河南省，居全國第2位[12]。目前，有關安徽不同產地芝麻中木酚素含量、總酚含量及抗氧化能力的研究報道較少。以安徽不同產地芝麻為原料，測定芝麻中木酚素及總酚含量、評價芝麻提取物的抗氧化能力、探討芝麻木酚素及總酚含量與抗氧化能力之間的相關性，對于正確認識芝麻活性成分的保健作用并合理利用芝麻資源具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原料：分別于2016年7月—12月購買安徽不同產地農戶自行種植的芝麻共22份，日光曬至水分含量5.5%～6.0%，密封袋密封，于-18℃條件下存放。

試劑：沒食子酸（99%純度）、甲醇（色譜純）、福林酚試劑（BR級），國藥集團化學試劑有限公司提供；2,2-聯苯基-1-苦基肼基（DPPH）、芝麻素、芝麻林素標準品（HPLC純度98%以上），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；芝麻素酚三糖苷標準品，實驗室自制，HPLC純度98%以上。

1.2 儀器與設備

FW-100型萬能粉碎機、SHA-S型往返式氣浴恒溫振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司產品；L-550型臺式低速大容量離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司產品；SHZ-Ⅲ型多功能循環水真空泵，鄭州上街華科儀器廠產品；ZFD-A5140型鼓風干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司產品；UV-5800PC型雙光束紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產品；LC-2010型液相色譜儀，日本島津公司產品；IMark酶標儀，美國BioTek公司產品。

1.3 芝麻提取物的制備

芝麻經日光曬干（水分含量5.5%～6.0%），經萬能粉碎機粉碎，過60目篩。按料液比1∶10（g∶mL）加入90%甲醇，于氣浴振蕩器中于室溫下振蕩浸提3 h，離心（4 500 r/min，10 min），收集浸提液，沉淀部分以相同方法浸提2次，將3次浸提液混合并減壓濃縮、真空干燥，即得芝麻提取物。稱取22份芝麻提取物各10 mg用90%甲醇溶解并定容至10 mL，經0.45 μm濾膜過濾，濾液分別用于木酚素、總酚含量和抗氧化能力分析。

1.4 芝麻中木酚素含量的測定

木酚素含量的測定采用高效液相色譜法，色譜條件如下：TSKgel ODS-80TsQA型（4.6 mm×250 mm）色譜柱，紫外檢測器，檢測波長290 nm，流動相：甲醇/水由初始10/90（mL/mL） 在60 min梯度變化為90/10（mL/mL），流速0.8 mL/min，柱溫35℃，進樣量20 μL，每個樣品檢測時間70 min。

精確稱取芝麻素、芝麻林素和芝麻素酚三糖苷標準品各10 mg，芝麻素和芝麻林素分別用甲醇溶解并定容至25 mL，芝麻素酚三糖苷用90%甲醇溶解并定容至25 mL，分別得到400 μg/mL標準品母液。然后將標準品母液分別稀釋得到質量濃度為5，20，40，80，100 μg/mL的標準溶液，并分別進行高效液相色譜檢測。以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

芝麻木酚素含量采用高效液相色譜檢測，根據保留時間是否與標準品一致進行定性分析，根據木酚素對應的峰面積，由標準曲線計算得出待測溶液中各木酚素質量濃度。芝麻中芝麻素、芝麻林素及芝麻素酚三糖苷的含量分別按公式（1）計算。芝麻總木酚素含量為三者之和。

式中：ω——分別表示芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷的含量，mg/g；

C——分別表示待測液中芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷的質量濃度，μg/mL，由對應的標準曲線獲得；

V——待測液的體積，mL；

m0——芝麻質量，g。

1.5 芝麻中總酚含量的測定

總酚含量的測定采用福林酚法[13]，準確量取芝麻提取物各0.5 mL，分別加入1.0 mL 0.1mol/L福林酚試劑，混勻，再加入4.0 mL飽和碳酸鈉溶液，混勻，避光靜置2 h，于波長765 nm處測定吸光度。以沒食子酸（GAE）為標準，總酚含量以每克芝麻提取物含有沒食子酸毫克數（mg GAE/g）表示。

1.6 芝麻提取物抗氧化能力

芝麻提取物抗氧化能力參照文獻[14]，方法如下：精確稱取10.0 mg DPPH自由基，用甲醇溶解并定容于25 mL棕色容量瓶中，然后用甲醇稀釋配成濃度為1×10-4mol/L DPPH自由基溶液，于4℃冰箱中避光保存。將芝麻提取物分別用90%甲醇稀釋至質量濃度為100 μg/mL，各量取30 μL，分別加入到96孔板中，每孔再分別加入240 μL甲醇和30 μL DPPH自由基溶液，混勻，于室溫下避光靜置30 min，然后用酶標儀于波長540 nm處測定吸光度。空白以90%甲醇取代樣品，則芝麻提取物對DPPH自由基清除率：

式中：d——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白對照于波長540 nm處吸光度；

Asample——待測樣品于波長540 nm處吸光度。

1.7 數據分析

采用SPSS V22.0（IBM-SPSS，USA） 軟件進行數據整理、制圖、方差分析和顯著性檢驗，試驗均重復3次，結果以平均值±標準偏差（X±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 安徽不同產地芝麻中木酚素含量比較

芝麻林素、芝麻素、芝麻素酚三糖苷及芝麻提取物的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷及芝麻提取物的高效液相色譜圖

以峰面積Y為縱坐標、質量濃度X為橫坐標，繪制標準曲線，分別得到芝麻素、芝麻林素和芝麻素酚三糖苷的標準曲線Y=37.167X-11.392（R2=0.998 6），Y=31.642X-20.491 （R2=0.998 9）， Y=11.093X+18.076（R2=0.997 8），線性范圍 5～100 μg/mL。由公式（1）計算得出安徽不同產地芝麻中芝麻素、芝麻林素和芝麻素酚三糖苷含量。

芝麻中木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基的清除能力見表1，黑白2組芝麻木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基的清除能力見表2。

表1 芝麻中木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基的清除能力

表2 黑白2組芝麻木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基的清除能力

由表1和表2可知，安徽不同產地芝麻中芝麻素含量范圍2.16～7.37 mg/g，芝麻林素1.09～3.73 mg/g，芝麻素酚三糖苷 0.46～2.76 mg/g，總木酚素 3.93～12.43 mg/g，平均含量分別為4.64±1.65，2.50±0.78，1.78±0.65，8.87±2.86 mg/g。芝麻素、芝麻素酚三糖苷的平均含量均高于文獻[15]芝麻素含量380.6±20.4 mg/100 g，芝麻素酚三糖苷含量68.4 mg/100 g以及文獻芝麻素含量4.34 mg/g和芝麻素酚三糖苷含量1.09 mg/g，但低于文獻[7]芝麻素5.24 mg/g及文獻[2]芝麻素酚三糖苷640±317 mg/100 g。研究中芝麻林素平均含量2.50±0.78 mg/g低于文獻[15]（276.5±13.8 mg/100 g），文獻[7]（3.30 mg/g） 但高于文獻[2]（2.27 mg/g） 報道。

黑白2組芝麻相比，白芝麻中芝麻素含量范圍4.47～7.37 mg/g（平均含量為 5.91±0.90 mg/g），芝麻林素 2.37～3.33 mg/g（平均含量為 2.90±0.32 mg/g），芝麻素酚三糖苷1.72～2.61 mg/g（平均含量為2.19±0.30 mg/g），總木酚素9.61～12.32 mg/g（平均含量為11.01±0.83 mg/g）；而黑芝麻中這幾種木酚素含量范圍分別為 2.16～5.94，1.09～3.37，0.46～2.76，3.93～12.43 mg/g，平均含量分別為3.36±1.15，2.10±0.89，1.36±0.65，6.73±2.53 mg/g。Rangkadilok N 等人[4]分析泰國黑芝麻和白芝麻中芝麻素含量分別為0.05～4.71 mg/g 和 0.74～7.23 mg/g，其中芝麻素含量最高的品種是中國白芝麻；與白芝麻相比，泰國黑芝麻中芝麻林素含量較低，不超過1.28 mg/g。試驗中黑芝麻各木酚素平均含量均低于白芝麻，這與文獻[2，7]報道基本一致。

黑白2組芝麻中木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基清除能力方差分析見表3。

由表3可知，黑白2組芝麻中芝麻素、芝麻素酚三糖苷及總木酚素含量差異極顯著（p＜0.01），芝麻林素含量差異顯著 （0.01＜p＜0.05），這與文獻[2，7]報道基本一致。黑白芝麻木酚素含量差異可能與品種、遺傳因素、生長環境（土壤、氣候、光照、肥料）、粒徑大小、蒴果分布、收獲時間、貯藏時間、提取溶劑及檢測方法等因素有關[2，4]。

表3 黑白2組芝麻中木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基清除能力方差分析

芝麻中木酚素含量、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基清除能力相關性分析見表4。

由表4可知，芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷與總木酚素含量之間的相關系數分別為0.957，0.872，0.867，在0.01水平上顯著；芝麻素與芝麻林素、芝麻素與芝麻素酚三糖苷、芝麻林素與芝麻素酚三糖苷之間的相關系數分別為0.722，0.740，0.799，在0.01水平上顯著。結果表明，安徽不同產地22種芝麻中各木酚素含量之間顯著正相關，這與文獻[5]報道的芝麻素和芝麻林素含量呈顯著正相關基本保持一致，其原因在于芝麻素和芝麻林素具有相似的生物合成途徑，但文獻卻報道芝麻中各木酚素含量之間沒有相關性。

表4 芝麻中木酚素含量、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基清除能力相關性分析

2.2 安徽不同產地芝麻中總酚含量比較

芝麻中總酚含量采用福林酚法測定（見表1）。采用SPSS V22.0軟件對表1數據比較均值（見表2）及方差分析（見表3）。由表2可知，芝麻中總酚含量為 3.13～3.97 mg GAE/g，平均含量為 3.60±0.28 mg GAE/g；黑白2組芝麻中總酚含量分別為3.13～3.95，3.25～3.97 mg GAE/g，平均含量分別為3.49±0.30，3.71±0.22 mg GAE/g，黑白2組芝麻中總酚含量差異不顯著（p=0.068＞0.05），說明黑白2種顏色芝麻中總酚含量沒有明顯差異。安徽地區白芝麻中總酚含量變化范圍大于Lin X等人報道的范圍3.70～7.86 mg GAE/g，其原因可能與芝麻品種、生長環境及提取檢測條件有關。研究中黑白2組芝麻中總酚含量沒有顯著差異，這與Shahidi F等人[9]報道不一致，他們采用80%乙醇浸提黑芝麻和白芝麻，所得提取物中總酚含量分別為29.9±0.6，10.6±1.6 mg/g（以每1 g提取物中毫克兒茶素當量計），黑芝麻提取物中總酚含量約是白芝麻的5倍。然而通過比較山西省3種黑芝麻和白芝麻總酚含量，黑白芝麻中總酚含量分別為 4.54～7.32 mg GAE/g，3.56～4.04 mg GAE/g，白芝麻中總酚含量高于黑芝麻，但二者之間差異不顯著。

2.3 安徽不同產地芝麻提取物對DPPH自由基清除能力比較

DPPH自由基比羥基自由基和超氧自由基更加穩定[10]，因此DPPH自由基清除能力常被用作評價抗氧化能力的一種方法。研究采用DPPH自由基清除能力評價安徽不同產地芝麻提取物的抗氧化活性，結果見表1和表2。22種芝麻提取物對DPPH自由基清除率范圍為65.34%～81.44%，黑白2組芝麻提取物對DPPH自由基清除率范圍分別為65.34%～81.44%和66.42%～79.19%，2種顏色相比，黑芝麻提取物對DPPH自由基清除率范圍及平均清除率均大于白芝麻，但差異不顯著（p=0.680＜0.05，見表3）。這可能是由于提取溶劑、芝麻品種及生長環境條件不同，芝麻提取物中抗氧化物質含量不同，對DPPH自由基清除能力也會有所不同[2]。

眾多學者認為芝麻提取物的抗氧化活性與抗氧化成分（如芝麻素、芝麻林素及酚類物質）有關，但也有研究報道芝麻提取物的抗氧化活性與芝麻木酚素含量沒有直接關系[2]。研究針對DPPH自由基清除能力是否與芝麻木酚素及總酚含量相關進行了分析（見表4）。由表4可知，芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷及總木酚素含量與DPPH自由基清除率之間的相關系數分別為0.228，0.319，0.279，0.289，在0.05及0.01水平均不顯著，說明芝麻中各木酚素與DPPH自由基清除能力沒有相關性，這與Kumar C M等人[10]報道基本一致。芝麻中總酚含量與DPPH自由基清除率之間的相關系數為0.543，在0.01水平顯著，說明芝麻中總酚含量與DPPH自由基清除能力顯著相關，這與文獻[11]報道一致。

3 結論

采用HPLC法測定安徽不同產地22種芝麻中芝麻素、芝麻林素及芝麻素酚三糖苷含量，采用福林酚法測定芝麻中總酚含量、DPPH自由基清除活性評價芝麻提取物的抗氧化能力。22種芝麻中芝麻素、芝麻林素及芝麻素酚三糖苷含量分別為2.16～7.37，1.09～3.73，0.46～2.76 mg/g。黑白 2 組芝麻相比，黑芝麻中芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷及總木酚素含量顯著低于白芝麻，各木酚素含量之間呈顯著正相關。22種芝麻中總酚含量為3.13～3.97 mg/g。黑白2組芝麻相比，總酚含量差異不顯著。芝麻中總酚含量與各木酚素含量呈顯著正相關。22種芝麻提取物對DPPH自由基清除率為65.34%～81.44%，黑芝麻提取物對DPPH自由基清除能力高于白芝麻提取物，但差異不顯著。22種芝麻提取物對DPPH自由基清除能力與各木酚素含量無相關性，但與芝麻中總酚含量呈顯著正相關。

芝麻作為傳統健康食品，深受消費者青睞，其健康作用與木酚素含量、總酚含量及芝麻提取物的抗氧化能力是否相關，一直備受關注。由于芝麻品種、生長環境、氣候條件、田間管理、貯藏時間等因素的影響，芝麻木酚素及總酚含量可能存在不同程度的差異。目前，抗氧化能力體外測定常用方法主要有以脂質氧化降解為基礎的方法（如過氧化值法、硫代巴比妥酸反應物法、硫氰酸鐵法等）、以清除自由基為基礎的方法（如DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基、超氧陰離子等清除能力）、螯合過渡金屬防止產生自由基的方法（如鐵離子螯合能力、銅離子螯合能力等）、測定待測物的還原能力的方法（如鐵離子還原能力、銅離子還原能力）及其他方法（如電化學法、高效液相色譜法等）[16]。由于沒有統一的標準方法，所以在研究物質的抗氧化能力時，所采用的方法因研究者偏好及試驗條件的影響而不同。與羥基自由基、超氧自由基相比，DPPH自由基穩定[10]，因此DPPH自由基清除能力常被用作評價抗氧化能力的一種方法，這也是試驗采用DPPH自由基清除活性評價芝麻提取物的抗氧化能力的原因之一，但也存在著方法單一、測定結果不能與其他測定方法相比較等問題，因此有關芝麻提取物的抗氧化能力有待于結合多種測定方法進一步深入研究。