春砂仁中總黃酮提取工藝的優化

鐘旭美，陳銘中，姚 菲

（陽江職業技術學院食品與環境工程系，廣東陽江 529566）

春砂仁（Amomum villosum Lour.）是著名的“四大南藥”之一，在中國傳統醫學中具有行氣、止痛、化濕開胃、健脾消脹、安胎止嘔的功能[1-2]；作為食品原材料，在調味品香辛料和保健食品領域應用廣泛[3-5]。廣東省陽春市產陽春砂仁最為著名，稱為道地南藥春砂仁，也為主流的商品藥材，在廣西、福建、四川等地也有引種[6-8]。黃酮類化合物是一類在植物界中分布廣泛、具有多種生物活性的多酚類化合物，是春砂仁的有效成分之一，具有抑菌、降壓、抗氧化等多種藥理作用[9]。試驗采用有機溶劑提取法，對春砂仁中的黃酮類物質進行提取[10]，探究春砂仁中總黃酮提取工藝優化，以槲皮苷為評價指標，用紫外分光光度計對提取物中總黃酮含量進行測定[11-12]，以期得到簡易可行的工藝方法，為陽春市的春砂仁產業的精深加工提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

春砂仁，購于陽江市藥房；槲皮苷標準品，上海源葉生物科技有限公司；甲醇、氯化鋁，均為分析純。

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司產品；FS250Y-3型粉碎機，廣州雷邁機械設備有限公司產品；FA2204B型電子天平，上海精科美科學儀器有限公司產品；I3型紫外可見分光光度計，濟南海能儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮提取工藝

干燥春砂仁→粉碎后過40目篩→取樣→加入甲醇提取→過濾→分離提取物→成品[13]。

1.2.2 槲皮苷標準曲線的繪制

（1）吸收曲線測定。精密稱取干燥的槲皮苷標準品11.2 mg，配制槲皮苷標準溶液質量濃度為0.112 mg/mL，吸取0.4 mL置于10 mL容量瓶，加5%AlCl31 mL，搖勻，放置5 min，加甲醇至刻度，搖勻后放置5 min，以甲醇試劑作為空白參比，用紫外分光光度法于波長400～450 nm處掃描，得到槲皮苷溶液吸收曲線。

（2）標準曲線繪制。精密吸取槲皮苷標準溶液0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別置于 10 mL容量瓶，加5%AlCl31 mL搖勻，放置5 min，加甲醇至刻度，搖勻后放置5 min，以甲醇試劑作為空白參比，用紫外分光光度計，根據吸收曲線得出的最大波長處測定吸光度，得到槲皮苷的標準曲線[14]，總黃酮得率由提取液槲皮苷含量計算。

1.2.3 單因素試驗

（1）甲醇體積分數對提取率的影響。準確稱取1.00 g春砂仁粉，選擇料液比為1∶40，分別加入體積分數為40%，50%，60%，70%，80%，90%的甲醇，提取溫度70℃，回流提取時間1 h，測定吸光度，計算總黃酮提取率，平行試驗3次。

（2）提取時間對提取率的影響。準確稱取1.00 g春砂仁粉，選擇甲醇體積分數70%，料液比1∶40，提取溫度70℃，分別提取30，60，90，120，150，180 min，測定吸光度，計算總黃酮提取率，平行試驗3次。

（3）提取溫度對提取率的影響。準確稱取1.00 g春砂仁粉，選擇甲醇體積分數70%，料液比1∶40，分別在提取溫度40，50，60，70，80，90℃的條件下提取1 h，測定吸光度，計算總黃酮提取率，平行試驗3次。

1.2.4 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，確定Box-Behnken設計自變量，以總黃酮提取率為響應值，利用Design Expert軟件進行響應面分析優化提取條件，考查甲醇體積分數、提取溫度和提取時間這3個因素之間的交互作用，確定最佳提取水平[15]，每組試驗重復3次。1.2.5 數據處理

曲線繪制與單因素試驗數據采用Origin 8.5軟件處理作圖，響應面方法設計與試驗數據采用Design Expert 8.0.6軟件處理分析。

2 結果與分析

2.1 槲皮苷標準曲線的繪制

2.1.1 吸收曲線

標準溶液吸收曲線見圖1，槲皮苷標準曲線見圖2。

根據圖1的吸收曲線，得到槲皮苷的最大吸收波長為415 nm。

圖1 標準溶液吸收曲線

圖2 槲皮苷標準曲線

2.1.2 標準曲線的繪制

以槲皮苷質量濃度（X）為橫坐標、波長415 nm處的吸光度（Y）為縱坐標，繪制槲皮苷標準曲線。線性回歸方程為Y=0.170 2X-0.001 1，R2=0.999 7。試驗結果表明，在一定范圍內，吸光度與槲皮苷質量濃度間的線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 甲醇體積分數對提取率的影響

甲醇體積分數70%～90%，隨著甲醇體積分數的增加，春砂仁總黃酮的提取率逐漸升高，在甲醇體積分數為90%時總黃酮提取率最高，所以選擇體積分數90%的甲醇為宜。

甲醇體積分數對春砂仁總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 甲醇體積分數對春砂仁總黃酮提取率的影響

2.2.2 提取時間對提取率的影響

提取時間對春砂仁總黃酮提取率的影響見圖4。

由圖4可知，當提取時間小于120 min時，春砂仁總黃酮的提取量逐漸增加，當提取溫度超過120 min時，春砂仁總黃酮的提取率開始下降，因此選擇提取時間為120 min最適宜。

2.2.3 提取溫度對提取率的影響

圖4 提取時間對春砂仁總黃酮提取率的影響

提取溫度對春砂仁總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對春砂仁總黃酮提取率的影響

由圖5可知，在整個提取過程中，隨著提取溫度的升高，春砂仁總黃酮的提取率不斷增加。當提取溫度低于80℃時，隨著提取溫度的延長，總黃酮提取率快速增加。這是因為隨著提取時間的延長，總黃酮逐漸被浸提出來。當提取時間繼續增加時，總黃酮提取率的增加趨勢逐漸減緩，這是由于隨著提取時間的延長，大部分總黃酮被提取出來，提取效率降低。因此，80℃為適宜的提取溫度。

2.3 響應面優化試驗結果分析

在單因素的基礎上，選取甲醇體積分數（A）、提取時間（B） 和提取溫度（C） 3個因素和3個水平，通過Design Expert軟件Box-Behnken組合設計，以春砂仁總黃酮提取率為響應值，對春砂仁總黃酮的提取進行優化。

響應面試驗設計因素與水平設計見表1，響應面方法設計與試驗結果見表2，響應面試驗結果方差分析見表3，各因素交互作用對春砂仁總黃酮提取率的影響見圖6。

表1 響應面試驗設計因素與水平設計

利用Design Expert 8.0.6軟件，對表2中的數據進行二次響應面回歸擬合分析，得到春砂仁總黃酮提取率（Y）對A，B和C的二次多項回歸方程：

由表3可以看出，一次項A，C對總黃酮提取率的影響均達到了極顯著水平；二次項A2，C2，達到極顯著水平；交互項AC，BC達到了顯著水平；模型極顯著 （p=0.000 8），失擬項 （p=0.086 2＞0.05）不顯著，說明模型是合理的，模型決定系數R2為0.951 7，校正決定系數R2Adj為0.889 6，說明該模型擬合結果良好，能較好地反映春砂仁總黃酮提取率與甲酵體積分數、提取時間和提取溫度的關系。

表2 響應面方法設計與試驗結果

表3 響應面試驗結果方差分析

由圖6可知，各因素對春砂仁總黃酮提取率的影響，以甲醇體積分數和提取溫度均極明顯，表現為曲線較陡，而提取時間的影響相對較小，表現為曲線較為平滑，同時圖6（b） 圖6（c） 的等高線橢圓形狀明顯，說明甲醇體積分數與提取溫度、提取時間與提取溫度的交互作用較大，這與回歸方程的方差分析結果相一致。

2.4 最優工藝預測與驗證

根據響應面分析結果，甲醇浸提法提取春砂仁總黃酮的最佳工藝條件為提取時間100.91 min，提取溫度73.18℃，甲醇體積分數85.38%。在此條件下春砂仁總黃酮提取率為11.20%。為了檢驗響應面法得到結果的可靠性，采用上述優化的提取條件進行甲醇浸提法提取春砂仁總黃酮的試驗。考慮到實際操作情況，將試驗條件修正為提取時間101 min，提取溫度73℃，甲醇體積分數85%。在此條件下測試3次，春砂仁總黃酮的平均提取率為11.11%，實際值與理論值較相近，可見該模型可以較好地反映各因素對春砂仁黃酮提取率的影響，同時也證明了用該方法研究春砂仁黃酮提取的可行性。

圖6 各因素交互作用對春砂仁總黃酮提取率的影響

3 結論

試驗從成本和操作簡易的角度設計和優化提取工藝，重點對甲醇體積分數、提取時間、提取溫度3個因素進行響應面優化試驗，得到春砂仁總黃酮提取的最佳條件為提取時間101 min，提取溫度73℃，甲醇體積分數85%。在此條件下，春砂仁總黃酮的提取率為11.11%。試驗建立了良好的春砂仁總黃酮提取工藝，對春砂仁的綜合利用和精深加工提供參考。