響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取車前草中的熊果酸

孔 濤，范杰平*，胡小芳，曹 婧，張 璐，童 聲

(南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031)

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取車前草中的熊果酸

孔 濤，范杰平*，胡小芳，曹 婧，張 璐，童 聲

(南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031)

目的：優(yōu)化超聲輔助提取車前草中的熊果酸工藝。方法：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法，以熊果酸的提取率為響應(yīng)值，通過回歸分析各工藝參數(shù)與響應(yīng)值之間的關(guān)系，并由此預(yù)測最佳的工藝條件。結(jié)果：超聲提取的最佳條件為提取溫度75℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、功率480W、液固比5:1(mL/g)、提取時間25min，該條件下提取3次，熊果酸的提取率達(dá)到0.144%。結(jié)論：響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取車前草中熊果酸的預(yù)測準(zhǔn)確、方便，所得的最佳提取工藝條件高效、可行。

響應(yīng)面法；超聲提取；車前草；熊果酸

車前草又名車前、車輪草、豬兒草、錢串草等，為車前科植物(Plantago asiaticaL.)或平車前(Plantago depressaWilld.)的干燥全草。車前草分布范圍廣，為傳統(tǒng)草藥，具有清熱利尿、祛痰、涼血、解毒等功能，并且有止瀉、護(hù)肝、降壓、降壓血清轉(zhuǎn)氨酶、抗癌、抑菌和降低血清膽固醇的作用[1]。車前草中主要的有效成分有熊果酸、車前苷、桃葉珊瑚苷等。熊果酸(ursolic acid)又名烏蘇酸、烏索酸，屬三萜類化合物，在自然界分布比較廣泛。參照有關(guān)文獻(xiàn)，目前對熊果酸的藥理作用研究比較多[2-7]，對熊果酸提取的研究也比較多[8-11]，但對從車前草中提取熊果酸的研究相對較少。本研究采用超聲輔助提取車前草中的熊果酸，用響應(yīng)面法系統(tǒng)優(yōu)化其提取工藝。以期為車前草提取物及其制劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

車前草購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，烘干、粉碎、過篩、脫脂，備用；熊果酸對照品(純度≥98%) 瀏陽艾特天然產(chǎn)物研究與開發(fā)有限公司。

甲醇(色譜純)、石油醚(分析純)、無水乙醇(分析純)天津大茂化學(xué)試劑廠；高效液相色譜用水為二次水。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀(配有四元泵及自動進(jìn)樣器、DAD檢測器) 美國安捷倫公司；KQ-600D型數(shù)控超聲清洗器(超聲頻率40kHz、超聲最大功率600W、功率可調(diào)40%～100%、加熱最大功率800W、溫度可調(diào)10～80℃) 昆山市超聲儀器有限公司；分析天平、電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 熊果酸的提取

將干燥的車前草粉碎后過篩，參照文獻(xiàn)[12]，取20～40目的車前粉，用石油醚在55℃脫脂3次，干燥備用。精密稱取一定量的車前粉，加入一定量的乙醇，稱量，在一定的超聲波功率下提取一定時間后，擦干外壁，再稱量，用乙醇補(bǔ)充缺失的質(zhì)量，離心。用注射器抽取一定量上清液，過0.45μm濾膜，進(jìn)行檢測。每個實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。取其平均值。結(jié)果以提取率(E)的來表示。

式中：C為熊果酸的質(zhì)量濃度/(g/mL)；V為加入乙醇的體積/mL；m為車前草的質(zhì)量/g。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取熊果酸對照品9.8mg，加甲醇定容至10mL的容量瓶中，搖勻，配成質(zhì)量濃度0.98mg/mL的對照品溶液，分別進(jìn)樣0.5、5、10、20、3 0μL，每個樣重復(fù)3次，分別進(jìn)行進(jìn)樣分析。記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸曲線Y=401.21x＋34.026，R2=0.9999，其中Y為熊果酸峰面積/(mAU·s)；x為進(jìn)樣量/μg。結(jié)果表明熊果酸在0.49～29.4μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱溫25℃；流動相：甲醇-水(0.1%的H3PO4)(90:10，V/V)[13]；流速1mL/min；檢測波長λ=210nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液固比對提取率的影響

在溫度30℃、功率480W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時間20min的條件下，考察液固比5:1～25:1(mL/g)對提取效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 液固比對提取率的影響Fig.1 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of ursolic acid

由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，熊果酸的提取率隨著液固比的增大而減小，這與普通回流提取規(guī)律正好相反，這是由于在提取的過程中，車前草的質(zhì)量固定，隨著溶劑的增加，超聲波的穿透能力下降，所以熊果酸提取率反而減少。為驗(yàn)證這一點(diǎn)，固定液固比，而車前草的質(zhì)量和溶劑量都相應(yīng)增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 相同液固比、不同車前粉對提取率的影響Fig.2 Effect ofPlantago asiaticaL. amount at a constant liquid/material ratio of 5:1 on extraction rate of ursolic acid

從圖2可以看出，同一液固比的條件下，隨著車前草質(zhì)量的增加，溶劑量也相應(yīng)增大，提取率反而下降，同樣也說明了超聲波的穿透能力與車前草和溶劑的量有很大關(guān)系，車前草和溶劑的量越大，穿透能力越差，故熊果酸提取率越低。為了方便取樣，同時保證有較大的提取率，選擇2g左右的車前草，采用5:1的液固比。

2.1.2 提取溫度對提取率的影響

固定液固比5:1、超聲功率480W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時間20min，在30～70℃范圍內(nèi)考察溫度對熊果酸提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of ursolic acid

從圖3可以看出，車前草中熊果酸的提取率與提取溫度呈正相關(guān)，在70℃時，熊果酸的提取率最大，考慮到超聲儀器實(shí)際的承受能力，選擇70℃為最佳提取溫度。

2.1.3 提取時間對提取率的影響

固定液固比5:1、提取溫度70℃、提取功率480W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，在10～30min范圍內(nèi)考察提取時間對熊果酸提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時間對提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of ursolic acid

由圖4可以看出，在超聲波的作用下，熊果酸的提取率隨時間變長而逐漸增加，在25min達(dá)到最大值，隨后減小。這可能是由于提取時間過長，一些糖類和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)慢慢溶出，使得溶液黏度增大，熊果酸被吸附在固體基質(zhì)上而不易被提取出來。因此應(yīng)選擇25min作為最佳的提取時間。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響

固定液固比5:1、提取溫度70℃、提取功率480W、提取時間25min，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(60%～100%)對提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate of ursolic acid

由圖5可知，熊果酸的在乙醇體積分?jǐn)?shù)90%左右提取率最高。車前草中有很多極性不同的化合物，它們最適合的溶劑極性各不相同[14]。因此，熊果酸的提取率會隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增大后減小。

2.1.5 超聲功率對提取率的影響

固定液固比5:1、提取溫度70℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取時間25min，在360～600W范圍內(nèi)考察超聲功率對提取率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 超聲功率對提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasound power on extraction rate of ursolic acid

從圖6可以看出，隨著功率的增大，熊果酸的提取率逐漸增大，當(dāng)超過480W后，其增大不是很明顯，因而選擇480W為最佳超聲提取功率。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化車前粉中熊果酸的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

為優(yōu)化超聲輔助提取車前草中熊果酸的工藝條件[15]，采用經(jīng)典的三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，精密稱取2g左右的車前粉于具塞塑料管中，選取提取溫度(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、超聲功率(C)對車前粉中熊果酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。具體方案及結(jié)果見表1、2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Scheme and experimental results of response surface design

2.2.2 模型評價

利用Design-Expert軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到的數(shù)學(xué)模型為：

Y=0.1＋0.018A－0.001267B＋0.003356C－0.005548AB＋0.001097AC－0.001221CD－0.015A2－0.008588B2－0.008176C2

模型方差分析結(jié)果和各項(xiàng)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果列于表3。

表3 回歸模型各項(xiàng)方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

從表3可以看出，模型的F=19.08、P=0.0004＜0.05，說明本實(shí)驗(yàn)所采用的二次模型是很顯著的。PA、PA2、PB2、PC2均小于0.05，說明提取溫度以及3個因素的二次項(xiàng)都具有顯著影響；而交互項(xiàng)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取功率及缺失項(xiàng)顯著性較差，也說明三者的交互作用不大。決定因素R2=0.9608，也說明模型能夠很好的反應(yīng)響應(yīng)值的變化，擬合度好。各因素的效應(yīng)關(guān)系為提取溫度＞超聲功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.3 響應(yīng)面分析

圖7 各兩因素的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the pairwise interactive effects of three factors on extraction rate of ursolic acid

由圖7可以看出，當(dāng)提取功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)都固定時，提取率隨提取溫度的變化幅度較大，而提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)以及提取功率變化幅度較小，所以，提取溫度對提取率的影響較為顯著。通過最優(yōu)化分析，最佳的提取條件為提取溫度76.51℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)86.96%、提取功率496.32W、提取時間25min、液固比5:1，預(yù)測提取率為0.110%。但考慮到實(shí)際操作的局限性，將車前草的提取工藝修正為提取溫度75℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取功率480W、提取時間25min、液固比5:1。在此條件下，熊果酸的提取率為0.097%，與預(yù)測值基本相符，證實(shí)了該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。提取3次，熊果酸的提取率見表4。

表4 最佳工藝條件及其驗(yàn)證Table 4 Results of validation experiments under optimized extraction conditions

經(jīng)過3次提取，熊果酸的總的提取率達(dá)到0.144%。

3 結(jié) 論

3.1 采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法對超聲波輔助提取車前草中熊果酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，通過回歸分析建立相關(guān)性良好的方程，得到的最佳的提取工藝為提取溫度75℃、液固比5:1、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取時間25min、超聲功率480W，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值相符，證實(shí)該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。在此條件下，提取3次，熊果酸的提取率為0.144%。

3.2 與傳統(tǒng)的提取工藝不同的是，在一定液固比范圍內(nèi)，熊果酸的提取率隨著液固比的增大而減小，并且在同一液固比的條件下，隨著車前草和溶劑量的增大，提取率也呈下降的趨勢，這說明超聲波的穿透力與溶劑量呈負(fù)相關(guān)。

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Optimizzation of Ultrasound-assisted Extraction of Ursolic Acid fromPlantago asiaticaL. by Response Surface Methodology

KONG Tao，F(xiàn)AN Jie-ping*，HU Xiao-fang，CAO Jing，ZHANG Lu，TONG Sheng
(School of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

Objective: To optimize the ultrasound-assisted extraction of ursolic acid fromPlantago asiaticaL.. Methods: On the basis of single-factor experiments, response surface methodology (RSM) was used to explore the optimal conditions for extracting ursolic acid fromPlantago asiaticaL. following regression analysis of the relationship between extraction parameters and extraction rate of ursolic acid. Results: The optimal extraction conditions were extraction temperature of 75 ℃, ethanol concentration of 90%, ultrasound power of 480 W, liquid/material ratio of 5:1, and extraction time of 25 min. Under the optimal extraction conditions,the extraction rate of ursolic acid was 0.144%. Conclusion: The optimal extraction conditions are reasonable and effective.

response surface methodology (RSM)；ultrasound-assisted extraction；Plantago asiaticaL.；ursolic acid

TS201.1

A

1002-6630(2011)06-0080-05

2010-06-05

江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)(YC09B012)

孔濤(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锓蛛x。E-mail：b0421kongtao@163.com

*通信作者：范杰平(1974—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)榛し蛛x和精細(xì)化工。E-mail：jasperfan@163.com