34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌的藥物敏感分析及耐藥機制探討

蔣逸 ，沈佳麗 ，蔣文玥，史偉峰

（1.常州市武進人民醫院檢驗科，江蘇 常州 213161；2.常州市第一人民醫院檢驗科，江蘇 常州 213003）

0 引言

耐亞胺培南的銅綠假單胞菌（IRPA）耐藥性強，探討其耐藥機制可以為臨床醫生提供用藥指導[1]。本研究通過收集我院IRPA，通過PCR技術分析其耐藥基因，為有效控制耐藥菌株傳播提供依據。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象

收集本院2015年4月至2016年7月我院各個科室患者體液標本分離出的IRPA，共計34株。樣本來源為男性21例，女性13例，年齡24歲～63歲，平均年齡（43.2±13.2）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏試驗

采用法國梅里埃公司的VITEK2 COMPACT全自動細菌鑒定儀及配套的藥敏卡。以銅綠假單胞菌ATCC 27853為標準質控菌株，藥敏試驗采用Kirby-Bauer紙片擴散法，藥敏結果參照美國臨床和實驗室標準化委員會頒布的標準判定。

1.2.2 檢測基因

采取PCR法檢測碳青霉烯酶基因（IMP、VIM、SIM、GIM、SPM、OXA-2以及OXA-10）、超廣譜β-內酰胺酶基因（TEM、VEB、SHV、PER）、AmpC酶基因（PDC、DHA）并測序驗證；PCR法檢測整合酶基因(intIl、intI2和intI3)，并對整合酶陽性菌株進行整合子可變區的擴增，測序分析整合子可變區攜帶的耐藥基因盒；熒光定量PCR法檢測PA膜孔蛋白oprD2基因是否缺失，以及主動外排系統MexAB-OprM、MexXYOprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN的超表達情況。

1.3 觀察指標

分析34株IRPA的標本分布；RT-PCR結果。

1.4 統計學分析

錄入SPSS 18.0軟件。計量資料t檢驗；計數資料χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標本分布

34株IRPA中，痰標本占70.6%（24/34）、尿標本占(5/34)占14.7%、傷口分泌物占5.9%（2/34）、咽拭子占5.9%(2/34)、血標本占2.9%(1/34)。從科室分布來看，腦外科占的比重最大，占 58.8%（20/34）；其次是ICU占14.7%（5/34），呼吸內科5.9%（2/34），腫瘤科5.9%（2/34），普外科5.9%（2/34），其余來自其他科室如骨科、神經內科、泌尿外科,占8.8%（3/34）

2.2 藥物敏感分析

通過藥敏發現菌株對亞胺培南耐藥率最高，對阿米卡星最敏感，見表1。

表1 34株PA對11種抗菌藥物的藥敏分析

2.3 RT-PCR結果

34株IRPA中膜孔蛋白oprD2基因缺失11株，缺失率為32.4%。MexA超表達的PA有8株（23.5%），MexX超表達的PA有9株（26.5%），MexC超表達的PA有11株（32.4%），MexE超表達的PA有10株（29.4%）。

3 討論

3.1 TEM-1超廣譜β-內酰胺酶的產生

超光譜β-內酰胺酶由質粒介導，其基因型有TEM、SHV、OXA、CTX-M和其他型（PER、VEB、GES、CARB等）[2]。美國流行的ESBLs基因型以TEM-1為主，在歐洲以TEM-12型較常見，在亞洲以TEM-1居多。TEM-1超廣譜β-內酰胺酶能水解第三代頭孢菌素、第四代頭孢菌素如頭孢吡肟，單環B-內酰胺類抗生素。

3.2 膜孔蛋白oprD2缺失

銅綠假單胞菌外膜上存在微孔蛋白，這些微孔蛋白中發揮最為重要的為oprD2。oprD2僅允許相對分子質量小于350～400的糖類擴散。現已證明OprD2在亞胺培南耐藥菌株中的缺失[3]，說明亞胺培南是經特殊通道OprD2擴散的，OprD2丟失時可引發銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥。

3.3 主動外排泵超表達

主動外排泵系統結構由三部分組成：一是外膜通道蛋白；二是內膜蛋白；三是連結蛋白或輔助蛋白。目前在銅綠假單胞菌中發現有9種主動外排泵，以MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM最為多見[4]。主動外排泵系統調控基因有mexR、nalC和 nalD等[5]。

3.4 攜帶的I類整合子移動元件

I類整合子具有捕獲和表達外來耐藥基因盒的能力，細菌可以通過I類整合子不斷地從周圍環境中捕獲耐藥基因盒，形成耐藥基因多基因座[6]。I類整合子在IRPA形成及耐藥基因的水平播散中起重要作用[7]。

綜上所述，本文認為TEM-1超廣譜β-內酰胺酶的產生、膜孔蛋白oprD2缺失、主動外排泵超表達，以及攜帶的I類整合子移動元件是造成本院PA多重耐藥和耐藥基因播散的重要原因。