ORF1編碼的四種非結構蛋白可用于戊型肝炎病毒的基因分型

胡玲玲，王躍榮，鄭海音

（上海中醫藥大學附屬市中醫醫院檢驗科，上海 200071）

0 引言

戊型肝炎病毒（hepatitus E virus，HEV）是病毒性戊型肝炎的病原體，以感染青壯年為主，在中國內陸、墨西哥和東南亞地區等均發生過暴發流行，近年來，在發達國家戊型肝炎的流行增多[1]。孕婦患病率較高，且病情嚴重，容易導致流產、死胎等[2]。

HEV基因組全長約7.5kb，包括5ˊ非編碼區、3ˊ非編碼區和3個開放閱讀框（Openreadingframe,ORF）[3]。ORF1基因長度約為5082bp，編碼五種非結構蛋白：甲基轉移酶(methyltransferase)、多聚脯氨酸鉸鏈(poly-prolinehinge)、 解 旋 酶 (helicase)、木瓜樣半胱氨酸蛋白酶(papain-like protease)和RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase)。ORF1不僅與病毒的復制有關，而且還在病毒的培養、病毒適應及致病性等發揮作用。

HEV的不同基因型在致病性方面存在差異，感染后的臨床癥狀和病程結局也有所不同。核酸序列分析表明，目前能感染人類的HEV有4個基因型，分型的依據是全基因序列的核苷酸同源性，因此結果最為準確。但全基因測序歷時長耗費大，序列比對也比較困難，我們之前的研究[4]發現ORF1編碼的甲基轉移酶可作為HEV的分型依據，甲基轉移酶是HEV的ORF1所編碼的五個非結構蛋白之一，本研究選取ORF1編碼的其他的四個非結構蛋白來探討其是否可以用于HEV的基因分型，報道如下。

1 材料與方法

1.1 HEV參考株

Chi-XJ1株（NC_001434）為基因型4型，是GenBank中測序最全且比較準確的。基因2型只有墨西哥分離株(MEX-14)的全基因序列收錄在GenBank中，在此沒有列入研究，主要對基因1、3和4型進行探討。

1.2 多序列比對和系統進化分析

從 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov） 的GenBank中獲取了35株HEV病毒株，其基因組是測序完整的且能感染人類，包括12個1型病毒株，9個3型病毒株，14個4型病毒株。我們將這35株HEV全序列以及編碼蛋白質的基因片段采用Clustal W程序進行多序列比對，用treev32繪制基因進化樹，研究其進化關系。

2 結果

2.1 預測HEV的蛋白表達圖譜

在GenBank中僅可以下載到Chi-XJ1株(NC_001434)的主要蛋白質木瓜樣半胱氨酸蛋白酶、多聚脯氨酸鉸鏈、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶的編碼序列，我們用Clustal W將Chi-XJ1株編碼這四種蛋白質的完整的編碼序列與其他各株HEV基因組進行了比對，預測出其他GenBank中沒有給出的各株HEV的四種主要蛋白編碼區。

2.2 ORF1編碼的四種非結構蛋白的基因序列可用于HEV的基因分型

將通過以上方法所得到的四種非結構蛋白的基因序列用Clustal W進行比對，并用treev32進行進化分析，發現編碼木瓜樣半胱氨酸蛋白酶、多聚脯氨酸鉸鏈、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶這四種非結構蛋白的多序列比對均將這35株HEV正確的分成了3個基因型，且每株病毒都被正確的歸類到了自己的基因型中，與GenBank中的報道是一致的。所以我們有理由可以把木瓜樣半胱氨酸蛋白酶、多聚脯氨酸鉸鏈、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶這四種非結構蛋白作為HEV的分型依據，結果見圖1-圖4。

圖1 35株HEV木瓜樣半胱氨酸蛋白酶基因序列的進化樹分析

圖2 35株HEV多聚脯氨酸鉸鏈基因序列的進化樹分析

圖3 35株HEV解旋酶基因序列的進化樹分析

圖4 35株HEV的RNA依賴的RNA聚合酶基因序列的進化樹分析

3 討論

戊型病毒性肝炎是由HEV引起的肝臟病變，既可以引起臨床散發病例，也可以導致大規模的暴發流行。雖然目前尚未發現特異性針對戊型肝炎的治療藥物，但臨床上需根據戊肝患者的臨床類型、病情輕重及并發癥區別對待。

HEV感染的患者病毒RNA可較早的在糞便或血清中發現，但兩到四周后血清中才出現特異性IgM抗體，而特異性的IgG抗體出現較晚且長期持續存在，其中IgM抗體可作為HEV急性感染的標志。戊型肝炎的實驗室診斷主要包括RT-PCR檢測血清中HEV核酸，免疫電鏡法檢測糞便中HEV病毒顆粒，酶聯免疫檢測法檢測血清中抗HEV IgM和IgG抗體。核酸檢測是戊型肝炎診斷的金標準；電鏡法對儀器設備以及人員要求較高，應用受到限制；酶聯免疫檢測法可以對HEV定性檢測，成本較低，且靈敏度和特異度也較高，目前應用較為廣泛，但是不同檢測試劑的檢測結果時常有出現不一致的情況[1]，原因可能是重組抗原不能正確折疊，或HEV不同的基因型在非免疫優勢表位間存在差異。

一般認為HEV感染是急性自限性疾病，但2008年Kamar等[5]首先發現8例器官移植的患者發生了HEV慢性持續性感染，檢測其基因型為3型，另一項回顧性研究發現感染了HEV的患者進行器官移植60%以上進展成了慢性戊型肝炎[6]。

戊肝患者發病的嚴重性及預后與HEV的基因類型密切相關[7-9]，研究發現我國新疆、尼泊爾等地區孕婦感染1型HEV后病死率高達20%。有些伴有其他肝病的患者若同時感染4型HEV后，可引起迅速的肝纖維化、肝硬化或急性肝衰竭等癥狀。目前人體內檢測出的HEV有4種基因型[10]，基因1型和2型引起的HEV感染主要引起戊肝的爆發流行，且多是急性自限性。基因3型和4型HEV為人畜共患病原體，主要引起散發病例，近些年的發病呈上升趨勢。因此對于高流行地區的一些特殊人群采取有效的預防措施是必要的[11]。HEV的研究日漸深入，疫苗的研制也日趨成熟[12-13]，有望降低戊肝的發病率和死亡率。

隨著基因測序技術的快速發展，HEV分型是進行全基因或部分基因的測序，但全基因序列較長，可以嘗試選取較短的基因序列替代全基因組序列進行比對。ORF1可以編碼五種與病毒復制相關的非結構蛋白，其基因編碼序列都比全基因組序列短，且我們之前研究[4]已發現甲基轉移酶的基因序列可以代替全基因序列對HEV進行分型，如果其他四個ORF1編碼的非結構蛋白其編碼序列可以發揮同樣的作用，那么可以為HEV的分型提供更多、更簡便快捷的方法。

我們從GenBank中獲取了35株HEV病毒株，其基因組是測序完整的且能感染人類，包括12個1型病毒株，9個3型病毒株，14個4型病毒株。Chi-XJ1株（NC_001434）是GenBank中信息最全且比較準確的，以它為參照，明確的預測出ORF1編碼的四種非結構蛋白的基因序列，將這35株HEV的木瓜樣半胱氨酸蛋白酶、解旋酶、多聚脯氨酸鉸鏈和RNA依賴的RNA聚合酶基因序列分別用Clustal W進行多序列比對，并用treev32繪制進化樹，描述各病毒株之間的親緣關系，發現結果與GenBank中的報道是一致的，皆可以分為1型、3型和4型，與我們之前的研究[4]中HEV全基因組的多序列比對的進化樹結果一致，雖然各型內的進化關系稍有不同。但與HEV基因組全長相比，我們選取的片段具有更大的優勢，其中RNA依賴的RNA聚合酶只有1460bp；其他的基因序列則更短，木瓜樣半胱氨酸蛋白酶為479bp、解旋酶為734bp，多聚脯氨酸鉸鏈只有200bp。

綜上所述，通過本研究發現，只需設計合適的引物擴增出ORF1編碼的四種非結構蛋白木瓜樣半胱氨酸蛋白酶、RNA依賴的RNA聚合酶、解旋酶和多聚脯氨酸鉸鏈其中一個的基因序列，再將PCR產物測序并做進化樹分析即可簡便、快速的對HEV進行基因分型。