靈芝孢子粉多糖的分離純化、結構表征及免疫活性初探

馮蒙蒙，王海鳴，楊惠成， 孫 震， 孫秀蘭， 戴 軍*

（1.食品與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣東 廣州510065；3.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

靈芝是一種珍貴的藥用真菌，屬于擔子菌門擔子菌綱多孔菌科靈芝屬，又稱 “靈芝草”、“仙草”、“長生草”，在我國有悠久的藥用歷史[1]。傳統中醫視之為名貴滋補類藥材，有扶正固本、延年益壽之功效，是上等保健醫療佳品。靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細小的種子，具有靈芝的全部遺傳活性物質[2]。近年來藥理試驗表明，靈芝孢子粉比靈芝子實體具有更強更全面的生理活性，是靈芝的精華部分，具有抑制腫瘤細胞生長，調節、提高人體免疫力，降低膽固醇，提高肌體耐缺氧能力等功能[3-5]；靈芝多糖類化合物是靈芝孢子粉或子實體及菌絲體中主要的活性成分之一[6]。

目前，市場上對靈芝子實體多糖的研究及開發利用已經非常廣泛，從靈芝子實體中分離出來的多糖已有一百五十多種，其中大部分為β-型葡聚糖，少數為α-型葡聚糖[7]。另外，有文獻報道在已分離的靈芝子實體中具有β-（1→3）鍵連接的D-葡聚糖的活性較大[8]。然而，有關靈芝孢子粉的研究雖然已有近20年的時間，但關于從一種靈芝孢子粉中同時分離出多個多糖級分并對其進行結構表征和免疫活性研究的報道較少[9]。本文作者針對東北吉林某企業培育的一新品種靈芝的孢子粉，采用水浴回流法提取粗多糖，并進一步分離純化得到兩個多糖級分GLP1a和GLP1b，同時對這2個組分的基本結構和免疫活性進行初步的研究。本研究對了解和評價該品種靈芝孢子粉及其多糖的質量和特點，進而深入研究其多糖構效關系及更好的開發利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品：赤芝破壁孢子粉由吉林某企業提供；

試劑：苯酚、濃硫酸、三氯甲烷、正丁醇、三氟乙酸（TFA），國藥集團化學試劑有限公司產品；甲醇、乙腈，美國Tedia公司產品；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），美國Acros Organics公司產品；四甲基偶氮唑藍（MTT），美國Biosharp公司產品；DMEM培養液，美國Gibco公司產品；

樹脂D101，河北滄州寶恩材料有限公司產品；DEAE Sepharose Fast Flow，美國GE Healthcare公司產品；Sepharose CL-6B，美國GE Healthcare公司產品；MD44-3.5透析袋，美國Viskase公司產品。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200高效液相色譜儀，配紫外檢測器，Agilent公司產品；Waters 1525高效液相色譜儀，配2414示差折光檢測器，Waters公司產品；Spectra Max M2多功能酶標儀，美谷子儀器有限公司產品；氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司產品；BSZ-100自動部分收集器、玻璃層析柱，上海滬西分析儀器廠有限公司產品。

1.3 孢子粉多糖的提取

稱取約20 g已破壁靈芝孢子粉樣品置于500 mL的平底燒瓶中，按料液比 1∶20（g/mL）加入 400 mL去離子水，搖勻，在100℃下水浴回流提取6 h，真空抽濾，水提液濃縮至適量，加入三倍體積無水乙醇在4℃下靜置過夜，8 000 r/min離心20 min，沉淀依次用95%乙醇和無水乙醇洗滌，離心后去上清，40℃真空干燥。

將粗多糖配成10 g/L的多糖溶液50 mL置于三角瓶中，加入3.0 g D101樹脂，于140 r/min、50℃下震蕩脫色4 h。脫色后的多糖溶液按體積比5∶1加入Sevag試劑，強烈震蕩20 min，靜置分層后除去白色絮狀物和氯仿相，重復此過程直到白色絮狀物不再出現。

1.4 多糖的分離純化

1.4.1 將1.3中脫色脫蛋白質后的粗多糖配制成30 g/L左右的多糖溶液10 mL，經過DEAE Sepharose Fast Flow 層析柱（2.6 cm×30 cm）進行陰離子交換色譜分離，自動部分收集器收集200管，1～100 管用 pH 7.8、0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液進行洗脫，101～200 管用 0.01～1.0 mol/L NaCl-0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為8 mL/min，1 min/管。通過苯酚硫酸法跟蹤檢測每一管的多糖含量，繪制洗脫曲線，合并相同級分，分別透析、濃縮及凍干。

1.4.2 將1.4.1獲取的多糖級分通過Sepharose CL-6B柱（2 cm×100 cm）進行凝膠過濾色譜分離，洗脫液為 0.1 mol/L NaCl，流速 0.5 mL/min，10 min/管，共收集100管，采用苯酚硫酸法跟蹤檢測每一管的多糖含量，繪制洗脫曲線，合并相同級分，分別透析、濃縮及凍干。

1.5 HPSEC分析

1.5.1 色譜條件 Shodex OHpak SB-803、SB-804、805HQ 8.0 mmID×300 mmL三根柱串聯，檢測器為示差折光檢測器，以0.1 mol/L NaNO3溶液為洗脫液，流速為0.8 mL/min，柱溫為30℃，進樣體積為20 μL。

1.5.2 多糖樣品相對分子質量分析及純度鑒定將相對分子質量分別為 2.7×103、9.75×103、3.68×104、1.35×105、2.0×106的標準葡聚糖配成約 3 g/L 的標準溶液，進樣分析，由GPC軟件自動處理數據得到相對分子質量校正曲線方程。然后，將多糖樣品配制成10 g/L的水溶液，0.22 μm微孔膜過濾，同樣條件下進樣分析。

1.6 多糖級分的完全酸水解

多糖樣品的完全酸水解方法參照參考文獻[10]。

1.7 混合單糖標樣及多糖級分的PMP衍生化

混合單糖標樣和多糖樣品的衍生化方法參照參考文獻[11]。

1.8 HPLC分析條件

色譜柱為 ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm），以 0.1 mol/L pH 6.7 磷酸鹽緩沖液-乙腈（體積比為83∶17）為流動相，檢測波長為245 nm，柱溫為30℃，流速為 1.0 mL/min，進樣體積為 20 μL。

1.9 紅外光譜分析

分別稱取多糖級分1 mg置于研缽中，加入適量溴化鉀充分研磨，壓片，400～4 000 cm-1的范圍內掃描32次，分辨率為4 cm-1。

1.10 核磁共振分析

分別稱取約30 mg多糖樣品溶于D2O中，配置成飽和溶液，DSS做內標，VANCE III HD核磁共振儀，400 MHz，40℃條件下測1H NMR和13C NMR譜。

1.11 多糖樣品促進正常小鼠脾淋巴細胞的增殖實驗

2個多糖級分促進正常小鼠脾淋巴細胞增殖的實驗方法參照參考文獻[12]。

2 結果與討論

2.1 孢子粉多糖的分離級分

按照1.4.1的方法，靈芝孢子粉粗多糖由DEAE Sepharose Fast Flow柱層析得到中性多糖GLP1和酸性多糖GLP2兩個級分，如圖1所示。2個級分的得率分別為：GLP1，78.54%；GLP2，6.49%。GLP1 和GLP2經Sepharose CL-6B柱分離結果見圖2。由圖可知，經Sepharose CL-6B柱分離后中性多糖GLP1得到3個組分GLP1a、GLP1b和GLP1c，酸性多糖GLP2得到2個組分GLP2a和GLP2b。本文著重對相對分子質量較大的中性多糖級分GLP1a和GLP1b做進一步的結構表征和免疫活性討論（關于GLP1c和GLP2a、GLP2b的分析研究另文發表）。

圖1 靈芝孢子粉多糖在DEAE Sepharose Fast Flow柱上的分離洗脫曲線Fig.1 Elution profile of Ganoderma lucidum polysaccharide by DEAE Sepharose Fast Flow

圖2 GLP1和GLP2在Sepharose CL-6B柱上的分離洗脫曲線Fig.2 Respectively elution profiles of GLP1 and GLP2

2.2 多糖級分的純度測定及相對分子質量分布

HPSEC測得GLP1a和GLP1b的相對分子質量分布色譜圖于圖3，由圖可見，2級分均為單一對稱峰，說明GLP1a和GLP1b皆為均一多糖組分。同時按照1.5方法，由HPSEC測得5個多糖級分的重均相對分子質量（Mw）、數均相對分子質量（Mn）及相對分子質量分布寬度（Mw/Mn）如表1所示。

圖3 GLP1a和GLP1b的HPSEC圖Fig.3 HPSEC chromatogram of GLP1a and GLP1b

表1 5種多糖級分的相對分子質量分布Table 1 Relative molecular mass distribution of five polysacc-haride fractions

2.3 單糖組成

12個單糖標樣和2個多糖級分GLP1a、GLP1b的水解產物的PMP柱前衍生化反相高效液相色譜圖如圖4和圖5所示。根據12個單糖標樣峰的保留時間對GLP1a、GLP1b進行定性，由圖5可知，GLP1a和GLP1b主要由葡萄糖組成，其摩爾百分比分別為97.07%和95.96%，因此，GLP1a和GLP1b均為葡聚糖。

圖4 12種標準單糖經PMP衍生化后RP-HPLC圖譜Fig.4 Chromatography of PMP derivatives of twelve kinds of monosaccharides by HPLC

圖5 GLP1a和GLP1b經PMP衍生化后的RP-HPLC圖譜Fig.5 RP-HPLC chromatograms of GLP1a and GLP1b by PMP derivatives

2.4 紅外光譜分析

紅外光譜圖顯示，GLP1a和GLP1b的特征峰主要出現在 3 400，2 920，1 640，1 375 cm-1和 1 060 cm-1附近。其中3 400 cm-1附近較強、較寬的吸收峰是糖類的O-H伸縮振動，2 920 cm-1附近的弱吸收峰是糖類C-H的伸縮振動，這2組峰是糖類的特征吸收峰。1 640 cm-1附近的較強吸收峰是糖的C＝O伸縮振動，1 375 cm-1附近的峰是表示C-H的變角振動，1 000～1 200 cm-1附近寬吸收峰是吡喃環C-O-C和C-O的伸縮振動吸收峰。另外，896 cm-1附近較小吸收峰是典型的吡喃葡聚糖和β-型糖苷鍵連接的特征吸收峰[13-15]。

圖6 GLP1a和GLP1b的紅外光譜Fig.6 FT-IR spectrum of GLP1a and GLP1b

2.5 核磁共振分析

如圖7和圖8所示，GLP1a的1H NMR譜和1C NMR譜的異頭區域都只有一個信號峰，說明只有一種β構型的糖殘基組成；13C NMR譜信號峰分布在60～104 ppm區域之間，說明不含糖醛酸；δ82-84 ppm區域中無信號，說明為吡喃糖；異頭區域只顯示103.24 ppm一個信號，其連接碳的化學位移為70.19 ppm，說明GLP1a的主鏈為β-1，6-吡喃葡聚糖；其他峰信號均為未取代的碳信號[16-18]。

圖7 GLP1a的13H NMR譜圖Fig.7 13H NMR spectrum of GLP1a

由GLP1b的1H譜和13C譜圖（圖9和圖10）可知，GLP1b與GLP1a的結構基本相似，但是GLP1b在δ85.41 ppm和δ79.47 ppm處各有一弱峰，分別為發生氧取代的C-3和C-4的信號，說明部分1→6連接的葡萄糖在3位和4位有分支。

圖8 GLP1a的13C NMR譜圖Fig.8 13C NMR spectrum of GLP1a

圖9 GLP1b的13H NMR譜圖Fig.9 13H NMR spectrum of GLP1b

圖10 GLP1b的13C NMR譜圖Fig.10 13C NMR spectrum of GLP1b

2.6 體外對正常小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響

圖11 是上述2個相對分子質量較大的中性多糖級分GLP1a和GLP1b對正常小鼠淋巴細胞增殖影響的初步試驗結果，其結果顯示，多糖級分GLP1a和GLP1b對小鼠脾淋巴細胞的增殖均有一定的促進作用，并且都有明顯的量效關系。GLP1b促進小鼠脾淋巴細胞增殖的效果明顯高于GLP1a，這可能與其相對分子質量及結構有關。

圖11 GLP1a和GLP1b對正常小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Fig.11 Effect of GLP1a and GLP1b on the proliferation by splenic lymphocytes of normal mice

3 結語

從吉林某企業培育的一新品種靈芝的孢子粉中提取和分離得到5個多糖級分，其中2個中性多糖GLP1a和GLPb的重均相對分子質量分別為1.12×106、1.21×105。 單糖組成、紅外、核磁共振的分析結果表明：GLP1a和GLPb均為葡聚糖，主鏈均以β-（1，6） 糖苷鍵連接，GLP1b在部分 1→6連接的葡萄糖的3位和4位有分支。MTT實驗表明，2個多糖級分都能夠促進正常小鼠脾淋巴細胞的增殖，并且都存在明顯的量效關系，但GLP1b的活性明顯高于GLP1a。類似GLP1b的孢子粉多糖的結構分析曾有報道[19]，但類似GLP1b的孢子粉多糖的免疫活性和具有類似GLP1a的分子量及其糖苷鍵特征的葡聚糖在有關靈芝孢子粉多糖的研究文獻中尚未見報道。