熱應激時奶牛淋巴細胞基因表達研究進展

文 / 蘭欣怡 張 彬 羅佳捷

（湖南農業大學動物科學技術學院）

熱應激會引起細胞周期調控點G1/S或G2/M的阻滯，劇烈的熱應激還會誘導細胞凋亡。淋巴細胞凋亡率在冬季時最低，為0.44%，夏季高溫可顯著提高奶牛外周淋巴細胞的凋亡率，同時有研究數據顯示，淋巴細胞的凋亡率并不是在熱應激初期就上升，而是有明顯的滯后效應，即在熱應激初期牛舍溫度為28.53 ℃時凋亡率上升不顯著，而牛舍溫度33.17 ℃時淋巴細胞凋亡率達到最高，為17.79%（p<0.01），在熱應激末期（27.03 ℃）淋巴細胞的凋亡率有所下降，為5.53%（p<0.01）[1]。

1 金屬硫蛋白與動物細胞應激

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是重要的生理活性物質，具有廣泛生物學功能，尤以清除自由基、抗應激和調控細胞凋亡作用重要。MT是低分子量、富含半胱氨酸殘基并與金屬離子相結合的非酶蛋白質。輻射、創傷、束縛等多種應激因素均能誘導MT合成，肖定福等采用不同應激因子對小鼠作用，誘導肝臟合成MT，結果發現，創傷可在24 h內使MT誘導合成量迅速增高，但24 h后MT誘導合成量從222.86%很快下降到68.29%（相對未創傷組）[2]。因此MT在小鼠體內能快速解毒，同時有助于創傷愈合，提高細胞修復增殖速度。這可能與MT的抗氧化性能有關。張彬等采用125I標記金屬硫蛋白（125I-MT），對MT在奶牛公犢體內吸收、排泄、存留和分布等代謝規律進行了研究，并證實MT對心肌、肝細胞等具有保護作用[3]。MT對重金屬的解毒作用和抗氧化作用已被廣泛接受，它在體內分布廣泛，主要存在于胞質和核內，但其對細胞凋亡基因表達水平的影響還鮮見報道。

天然條件下，MT中的巰基均以還原狀態存在，其中的金屬具有動力學不穩定性，而巰基具有親核性，從而使MT易與親電性物質特別是某些自由基相互作用，可作為高效抗氧化劑清除自由基，降低自由基對細胞的毒害，增強機體應激反應能力[4，5]。MT的抗自由基作用是細胞保護的主要機制之一。損傷性刺激可誘導肝細胞內MT合成，給大鼠腹腔注射內毒素后，肝臟MT含量比對照動物增加62.6 倍，而脂質過氧化反應被明顯抑制。MT能清除OH自由基，調節細胞內的氧化還原反應。張彬等探討了外源性金屬硫蛋白對奶牛抗熱應激的調控作用，Zn-MT可顯著提高奶牛血液中GSHPX和紅細胞中SOD的活性，提高抗氧化酶SOD基因的表達水平[6]；2009年又研究了MT針對奶牛的泌乳性能和抗氧化狀況，得出一系列成果[7]。據報道，MT清除OH自由基的能力是超氧化物歧化酶（SOD）的1 000 倍，是谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的100倍，MT對OH自由基引起DNA降解的保護作用比還原型谷胱甘肽（GSH）強800 倍[8，9]，因而在細胞和組織中起保護DNA降解，使蛋白質和脂類物質免遭氧化應激損傷的重要作用。MT所具有的調控細胞凋亡的功能主要是通過其抗氧化作用，提高ATP酶活性，保護線粒體的功能和抑制促凋亡蛋白的表達[10]，或通過影響Bcl-2家族蛋白（又稱細胞凋亡調節蛋白）的表達而抑制應激引起的細胞凋亡[11，12]，或通過抑制線粒體Cytc的釋放及細胞凋亡蛋白酶Caspase-3的活化，進而抑制細胞凋亡而實現的[13]。MT能調節NF-κB的活性。NF-κB是調節炎性細胞因子、黏附分子、環氧合酶和NO合酶等基因表達的轉錄因子，在多數細胞中，NF-κB與它的抑制蛋白IκB結合，以無活性形式存在于胞質。TNF-α、IL-1和內毒素脂多糖等通過磷酸化和降解IκB使NF-κB轉移入核，并激活靶基因轉錄。研究發現，細胞內氧化反應狀態和活性氧也參與NF-κB活性的調節。MT在胞質可以抑制IκB的降解，從而阻止TNF誘導的NF-κB激活。MT還可能在核內與Zn結合，經調節鋅指結構影響NF-κB與DNA的結合。作為NF-κB活性的負性調節因子，MT能減少炎癥細胞因子的表達，從而起到細胞保護作用[14]。

2 RIP3在細胞內的定位

1995年，Stanger B Z等首次通過酵母雙雜交發現了一個與Fas相互作用的蛋白，因而命名為受體相互作用蛋白（receptor-interacting proteins，RIPs）。RIP家族蛋白是一類Ser/Thr蛋白激酶，與IRAK（interleukin-1-receptor-associated kinase）家族蛋白關系密切。它們不僅在結構上都具有一段保守的激酶結構域（kinase domain，KD），而且在功能上很相似，許多細胞脅迫因子（如病原體感染、炎癥反應、細胞分化、DNA降解等）都會引發細胞生存環境的改變，這些脅迫因子既有由細胞表面受體轉導的胞外信號，也有由細胞內環境改變引發的胞內信號，RIP家族成員就在這些刺激狀況下發揮重要作用。

RIP3過量表達能引發一種caspase依賴的細胞凋亡。該細胞凋亡的發生會依賴于IP3的C端，但不依賴于其激酶活性以及RIP3與RIP1相互作用的RHIM結構域。過量表達RIP3，并用TNF處理細胞后，發現缺失了C末端的RIP3（只剩N末端氨基酸1-436）會抑制TNF誘導的caspase的激活，但不影響TNF誘導的NF-κB信號通路，這提示RIP3的C末端在TNF誘導的caspase依賴的細胞凋亡途徑中發揮著重要的作用[15]。Yang Y等在Hela細胞中過量表達RIP3，發現RIP3定位于胞質，并且可以在細胞質和核之間穿梭。他們同時在RIP3上定位出1 段非經典的核定位和3 段富含亮氨酸的核輸出信號，分別為NLS（氨基酸442～472）、NES1（氨基酸255～264）、NES2（氨基酸344～354）、NES3Ⅰ（氨基酸116～126）和NES3Ⅱ（氨基酸121～131）[16]。其中NES1和NES2以CRM1依賴的方式介導RIP3出核，CRM1是一種主要的出核介導物，它與出核蛋白上的NES序列結合并將其轉運至核孔的出核部位；NES3則不需要CRM1的協助。NES1和NES2在鼠源RIP3內的同源序列分別為氨基酸260～268和339～349[17]。Leptomycin B（LMB）是從鏈霉菌中分離出來的一種不飽和支鏈脂肪酸，其末端帶有內酯環，它和CRM1的一個保守半胱氨酸巰基形成共價化合物，阻止CRM1和出核目標蛋白的NES序列相互作用，是一種有效的CRM1介導的出核轉運的抑制劑。Hela細胞中外源表達的RIP3在LMB于37 ℃處理后，大多定位于細胞核內，說明RIP3是一個能夠在核質間自由穿梭的蛋白質，其主要的核輸出方式是CRM1依賴的，即通過NES1和NES2實現。RIP3上NLS（氨基酸442～472）的31 個氨基酸殘基正是外源表達RIP3誘導凋亡的最小序列，Yang Y等據此推斷RIP3誘導細胞凋亡的功能可能與定位相關，在TNF刺激下，外源RIP3借助內源RIP3共定位于TNF-R1信號復合體上，隨后磷酸化RIP1，調控NF-κB的活化[16]。

3 細胞凋亡與熱應激反應

細胞凋亡在生物體的進化、內環境的穩定以及多個系統的發育中起著重要的作用。當暴露于各種理化及生物性刺激時，任何生物細胞（從細菌、酵母菌到高等動物細胞）都將出現一系列適應代償性反應。這些反應包括與損傷因素有關的特異性反應和與損傷因素關系不大的非特異性反應，統稱為細胞應激（cell stress）。在不同應激原作用下，生物細胞都可出現某些類似反應，如多種生物、理化應激原都可導致熱休克蛋白表達增加。過去不少學者傾向于將此視為“非特異性反應”，但是，不同應激原作用下熱休克蛋白表達的種類和水平差別依然很大。

熱應激反應能促進中性粒細胞凋亡并減少活性氧釋放。細胞受到不良因素刺激時，均可通過基因表達模式的改變而導致一系列稱為熱休克蛋白（HSPs）的合成，以維護細胞的結構和功能，并起著保護應激結果的作用。HSPs是熱應激反應的標志性產物，其中HSP70最為重要，分布在各種細胞中，并具有廣泛的保護作用。不同的組織細胞對同樣的熱休克具有不同的反應。如在小鼠整體熱休克時（42 ℃，15 min，恢復24 h），心臟組織以誘導HSP70和HSP90α表達為主，而肝臟組織則以誘導HSP27/25為主。生物細胞暴露于高溫（熱休克）時所表現的以基因表達變化為特征的防御適應反應稱為熱休克反應（HSR）。許多研究表明，機體應激時，應激因素的刺激會引起細胞凋亡、細胞周期阻滯和DNA損傷等多種反應，其中細胞凋亡可最大限度地減少機體非生理性細胞壞死，以減輕大量細胞壞死所致的毒副作用。馮建江等研究表明，熱適應處理明顯干擾熱應激細胞的細胞周期進程。夏季持續高溫容易對奶牛的生理機能造成影響，從而導致奶牛產奶量的下降[18]。據報道，夏季熱應激會造成奶牛外周血淋巴細胞的凋亡率顯著上升[1]。在熱應激初期，動物可通過自身調節來減弱熱應激反應，然而一旦超過自身調節的范圍，淋巴細胞凋亡率則大大升高。在高溫對奶牛乳腺上皮細胞凋亡試驗中，凋亡率在處理后6 h達到高峰，而后逐漸降低，細胞凋亡率隨熱應激程度的不同而不斷變化，也表現出細胞凋亡的滯后效應。蔡亞非等曾在高溫對奶牛外周血淋巴細胞凋亡率影響的試驗中同樣發現細胞凋亡存在滯后效應。此外，在熱應激下，處于不同細胞周期淋巴細胞比例也會發生變化[19]。

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