白僵菌對栗實象甲幼蟲血細胞數量的影響

趙俊芳，樊金華，冀衛榮

（山西農業大學林學院，山西 太谷 030801）

栗實象甲（Curculio davidi Fairmaire）又名栗實象鼻蟲、栗蛆，屬鞘翅目象甲科，為世界性板栗害蟲，該害蟲分布廣泛，是各個板栗產地的主要害蟲之一[1]。2015年我國板栗總面積達到180萬hm2，年產量195萬t，占世界板栗總產量的84%[2]。栗實象甲幼蟲危害果實，成蟲以取食栗樹的幼葉和嫩芽為主，晚上蟄伏在葉子重疊處。該害蟲繁殖能力極強，當晚進行交配第2天便可產卵，并且該成蟲反應靈敏，遇到危險時能迅速飛逃，導致防治效果一直不太顯著[3]。隨著社會進步和科學技術的發展，人們對該害蟲的防治方法越來越多，但近年來板栗害蟲防治效果仍不太明顯，每年仍有20%～45%的板栗果實受損害，嚴重地區可達70%以上，造成巨大的經濟損失[4-6]。

蟲生真菌在我國害蟲防治方面應用很廣泛。在我國北方，人們利用白僵菌成功防治了一種極難控制的森林害蟲——馬尾松毛蟲，在我國南方，使用白僵菌對水稻害蟲有著極好的防治效果。南非等國使用金龜子綠僵菌防治飛蝗害蟲，而巴西等國利用金龜子綠僵菌防治甘蔗沫蟬等害蟲。近些年，由于生物技術變得更加成熟，越來越多的蟲生真菌產品進入市場，產生了巨大的經濟效益，市場前景廣闊[7-8]。

本研究采用球孢白僵菌對栗實象甲幼蟲進行侵染，通過觀察蟲體的病變特征及血細胞數量的變化，了解球孢白僵菌對栗實象甲幼蟲的致病性及致病力，為球孢白僵菌投入實踐防治栗實象甲提供有力依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 本試驗使用從中國科學院購買的SYN01球孢白僵菌作為供試菌[9]。

1.1.2 供試蟲源 2016年10月下旬由山西省晉中市昔陽縣農家購買板栗，帶回學校，在地上平鋪塑料膜并蓋上一層新鮮濕潤的土壤，這時把板栗均勻平鋪在土壤上，等待幼蟲出土，每天保持土壤濕潤給幼蟲出土提供合適的條件。3 d左右就有幼蟲出土，每天從土里捉蟲并把幼蟲保存到合適的生存環境中，這種出土狀態大約保持14 d。取出來的栗實象甲幼蟲即為試驗對象。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試菌株及孢子懸浮液的制備 供試菌株球孢白僵菌SYN01，用PDA培養基（馬鈴薯2 g、葡萄糖 0.2 g、瓊脂 0.15～0.2 g、蒸餾水 10 mL，自然pH）培養，直到白僵菌完全產孢，在無菌環境下的操作臺里，用接菌環將5板球孢白僵菌SYN01刮入50 mL的三角瓶內，分別加入等量的20 mL含0.05%吐溫－80的蒸餾水，搖勻，制得濃度為3.2×108孢子/mL的白僵菌孢子懸液，然后取出少量，稀釋后得到1.6×107，8×106孢子/mL這2個濃度。

1.2.2 同種白僵菌的3個濃度對栗實象甲幼蟲的高致病力篩選 選擇狀態相同的栗實象甲幼蟲200只，將其隨機分為4組，3個試驗組1個對照組（以吐溫-80溶液為對照），用滅菌后的移液槍吸取10 μL準備好的球孢白僵菌孢子懸浮液，均勻滴涂于一只蟲體的體表。將感染不同濃度球孢白僵菌孢子懸浮液的蟲子分別放入滅過菌的有土燒杯中。將放有處理過蟲子的燒杯均置于恒溫培養箱（RH＞95%）中，等待血細胞的采集。

1.2.3 血淋巴的采集 用滅過菌的鑷子從燒杯中取4只蟲子，用75%的酒精對蟲體進行表面消毒，然后用無菌水沖洗干凈，用吸水紙吸干蟲體表面水分。

將蟲體固定，在靠近蟲體頭部的背面，用昆蟲針沿背面表皮穿刺，血淋巴會從傷口溢出，呈小水珠狀，用2.5 μL的移液槍吸取血淋巴。

1.2.4 血細胞的觀察和鑒定 將收集的淋巴液集于EP管中，管中有提前放入的預冷抗凝血劑以防止黑化。用移液槍在EP管中抽推幾次，以達到混勻的效果，然后用2.5μL的移液槍在EP管中吸取2μL的收集液，滴于用酒精擦拭過的血球計數板上，置于顯微鏡下觀察血細胞的個數，并記錄。

2 結果與分析

2.1 侵染后蟲體及血細胞的變化

栗實象甲幼蟲被真菌侵染后，48 h后蟲體由原來的淺黃色變為白色，體壁與對照相比質軟，穿刺更容易；72 h時部分蟲體出現針孔大小的黑死斑點，一只有5～8個斑點，此時活性明顯降低，同時取出的血淋巴呈渾濁且無形狀，內臟更易從傷口隨淋巴液流出，但對照為偏黃色透明水珠。

2.2 白僵菌對蟲體血細胞數量的影響

為了了解菌液對血細胞數量的影響，以侵染栗實象甲幼蟲的時間點為零點，以此類推，分別在侵染后的3，6，12，24，48，72，96 h 對血細胞數量進行統計。結果發現，在濃度為3.2×108孢子/mL的球孢白僵菌孢子懸液侵染下，栗實象甲幼蟲在3～6 h血細胞數量呈上升狀態，6～72 h時血細胞數量急劇下降并在72 h達到最低值。在1.6×107孢子/mL的白僵菌孢子懸液侵染下，3～6 h血細胞數量緩慢上升，在6～12 h血細胞數量恢復到與3 h時基本相同，12～48 h血細胞數量以上升狀態增長，48～96 h血細胞數量呈下降狀態并且在72 h數量也達到一個最低值。在8×106孢子/mL的白僵菌孢子懸液侵染下，栗實象甲幼蟲血細胞數量在3～96 h過程中血細胞數量一直是下降狀態，并在72 h達到最低值，之后變化較為平緩。CK組的栗實象甲幼蟲血細胞數量在3～12 h時呈上升狀態，12～96 h時呈急劇下降狀態，48 h后較為平穩（圖1）。總體上與對照組相比，試驗組的栗實象甲幼蟲血細胞的數量呈現出先升高后降低的動態變化。

3 結論與討論

栗實象甲是采用兩性生殖（Sexual reproduction）繁殖后代的，6—7月份成蟲羽化，在土中潛伏10～15 d，等到栗蓬長到核桃大小時鉆出土面，出土時期多集中于每年的7—8月[10]，白天在栗樹上取食栗樹的幼葉和嫩芽，取食一段時間，等到營養充足之時開始交配產卵且周期極短，次日便可產下，多數產卵于幼果果蒂附近的產卵孔，一般每孔產1～3顆卵。遇到危險時反應靈敏迅速飛逃，同時該害蟲還具有假死性，一般在夜里活動很少或者不活動，蟄伏于栗葉重疊處，趨光性不強[11-12]。昆蟲的血細胞種類繁多，傳統上根據血細胞的大小、組成以及功能來分類。近年來，開始應用基因標記等技術進行分類[13]。其血細胞中的漿細胞和粒血胞占很大比例，所以，這2種細胞同時也是栗實象甲免疫反應的2種重要細胞。正常生活的栗實象甲幼蟲在3～6 h內體內血細胞數量呈上升狀態且變化幅度不大。感染了白僵菌孢子原液的栗實象甲幼蟲，起初由于體內免疫反應導致了血細胞數量的急劇增加，然后隨著時間推移，在6～72 h血細胞數量急劇下降，經過72 h血細胞數量趨近于0，這時的昆蟲致死率極高，72 h后尚存活的栗實象甲幼蟲由于免疫系統較為強大，血細胞數量呈上升狀態。感染了濃度為1.6×107孢子/mL的白僵菌孢子懸液的栗實象甲幼蟲，起初由于體內免疫反應比正常生活的幼蟲血細胞數量較多一些，直到72 h，血細胞數量與正常生活的幼蟲較為相近，但是比正常生活的高一些，72～96 h體內血細胞數量緩步上升，96 h以后由于體內適應了白僵菌的感染，血細胞數量呈穩定上升狀態。感染了濃度為8×106孢子/mL的白僵菌孢子懸液的栗實象甲幼蟲，其血細胞數量走勢也和前幾種類似，在72 h之內血細胞數量呈下降狀態，由于白僵菌孢子懸液稀釋成8×106孢子/mL，幾乎對蟲體無影響，因此，72 h以后體內血細胞數量呈急劇上升狀態，96 h以后血細胞數量緩慢減小。蟲生真菌的優勢在于，它可以直接進入昆蟲的體腔，并在其體內發揮作用。因此，蟲生真菌能侵染其他病原物不能侵染的害蟲發育的各個時期。正因為這樣，蟲生真菌比大多數生物殺蟲劑的效果都要好很多。

雖然蟲生真菌的優勢這么明顯，但也不是所有的效果都很好，因為真菌需要發揮作用不僅只靠自身，而且也看環境和寄主是不是合適[14-15]。對于昆蟲本身而言，真菌作為一種外來入侵物，一般都會使昆蟲自身產生免疫反應，但效果不一定明顯，也就是說昆蟲體內的免疫系統不一定能把蟲生真菌消滅。因此，一旦環境適合蟲生真菌入侵到昆蟲體內，昆蟲自身的免疫反應很難發揮作用，但昆蟲有時候能夠通過自身的血細胞發揮作用，阻止孢子的萌發，降低感病概率[16]。