谷子SibZIP8超量表達載體的構建

成 亮，劉 盼，邢恒榮，張 莉

（1.山西藥科職業(yè)學院，山西 太原 030031；2.山西農業(yè)大學農學院，山西 太谷 030801）

研究表明，植物在逆境環(huán)境中，轉錄因子能夠通過抑制或激活下游基因的表達從而更好地適應環(huán)境的改變[6-7]。植物bZIP轉錄因子能夠與ABA響應基因啟動子區(qū)域的ABRE（ABA-responsive element）保守位點CACGTG結合調控下游基因的表達。擬南芥ABF/AREB類bZIP轉錄因子家族共有4 個 基 因 ， 包 括 ABF1，ABF2/AREB1，ABF3 和ABF4/AREB2。其中，ABF1在響應低溫反應中具有非常重要的作用，而ABF2，ABF3和ABF4則響應干旱、強酸、高鹽、高溫和氧化等逆境脅迫[8]。

植物在生長發(fā)育過程中受到種種制約，例如病蟲害、干旱、鹽堿、水澇、高溫、冷寒等，這些逆境脅迫促使植物在進化過程中形成了可適應環(huán)境變化的調控機理，使得植物在受到環(huán)境的刺激后能夠從基因分子水平進行調控，從而抵御外界環(huán)境所帶來的威脅。因此，探明農作物響應非生物脅迫的分子機制并進行生產應用受到越來越多的重視。

谷子（Setaria italica）是我國北方地區(qū)的主要農作物之一，是一種抗旱、耐貧瘠、適應能力強的作物，是植物抗逆性研究中理想的模型[9-10]。通過轉基因技術研究谷子響應逆境脅迫的分子機制并對谷子進行改良，是提升谷子農業(yè)應用能力的一項重要的措施。

為了探索SibZIP8基因在谷子抗逆脅迫中的作用，本研究擬構建SibZIP8基因的超量表達載體，通過轉基因技術揭示SibZIP8的調控機制，旨在為解析bZIP轉錄因子介導的谷子抗旱機制研究奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試谷子品種為晉谷21，表達載體為pCAMBIA1302，均由山西農業(yè)大學提供。

1.2 試劑

Taq酶來自上海勁馬實驗設備有限公司；限制性內切酶均為北京天恩澤生物有限公司產品；RNA提取試劑盒為上海索萊寶生物科技有限公司生產；反轉錄酶、DNA凝膠回收試劑盒由上海伯易生物有限公司生產；RNA酶抑制劑、質粒提取試劑盒和DH5α感受細胞均為天根生物化學科技有限公司產品；PCR引物的合成和測序由北京華大基因研究中心完成。

1.3 表達載體pCAMBIA1302-SibZIP8的構建材料與方法

1.3.1 谷子總RNA的提取 在山西農業(yè)大學農作站采集谷子嫩葉少許，在液氮中研磨，然后用RNA提取試劑盒提取，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的完整性，接著以mRNA為模板，用反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.3.2 PCR擴增：聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction） 根據(jù)SibZIP8基因的CDS序列設計PCR擴增引物。在正向引物的5′端引入Nco1（CCATGG）酶切位點，在反向引物的5′端引入BstZ17I（GTATAC）酶切位點。

由圖4和表3可知，雙層干燥模式整體來說，各干燥層的水分擴散系數(shù)差異較小，平均值最大，約為1.1×10-4m2/s，原因是層數(shù)的變換使得風速和溫度的分布相對均勻，物料中的水分能夠迅速蒸發(fā)，從而促進了水分擴散。lnMR和干燥時間線性相關系數(shù)高，各干燥模式不同干燥層的擬合系數(shù)R2均大于0.92。而3層干燥模式的水分有效擴散系數(shù)均值最小，約為0.81×10-6m2/s，主要與干燥層數(shù)有關，層數(shù)增加使得風速、溫度分布不均勻，影響水分轉移。

以反轉錄后的cDNA作為擴增模板。PCR擴增條件為：預變性條件95℃，5min；變性條件95℃，30 s，復性條件 56 ℃，30 s，延伸條件 72 ℃，1 min，34次循環(huán)；72℃條件下延伸10 min。通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，有單一的明亮條帶，用DNA凝膠回收試劑盒進行PCR產物回收。

1.3.3 pCAMBIA1302-SibZIP8超表達載體構建取用含有pCAMBIA1302質粒的大腸桿菌進行搖菌，等菌液濃度達到OD600值為0.4～0.5后，利用質粒提取試劑盒提取質粒。pCAMBIA1302質粒和上一步中純化的PCR產物同時用Nco1和BstZ17I進行雙酶切。酶切產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，再用DNA凝膠回收試劑盒對雙酶切后的線性化質粒和PCR產物進行回收。雙酶切后的基因片段利用T4連接酶與線性化載體連接，用Ca2+處理DH5α細胞呈感受態(tài)以吸收重組載體進入到受體細胞，獲得重組質粒，即pCAMBIA1302-SibZIP8超表達載體，最后進行藍白斑篩選，獲得白斑菌落，提取質粒DNA，并進行測序。

2 結果與分析

2.1 SibZIP8的CDS擴增和檢測

通過檢索谷子基因組數(shù)據(jù)庫，獲得SibZIP8 CDS序列（Si017618m），序列如圖1所示。

在正向引物5′端引入Nco1酶切位點和反向引物5′端引入BstZ17I酶切位點，得到擴增引物序列如下。

下一步以反轉錄得到cDNA為模板，以SibZIP8cDNA-F和SibZIP8cDNA-R為引物進行PCR擴增。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示。

2.2 pCAMBIA1302-SibZIP8超表達載體構建

采用1.3.3的試驗方法，構建pCAMBIA1302-SibZIP8重組載體，如圖3-A所示。用Nco1和BstZ17I雙酶切pCAMBIA1302-SibZIP8，然后進行電泳檢測，結果如圖3-B所示，SibZIP8基因已經(jīng)成功與載體進行了連接。

為了進一步確認pCAMBIA1302-SibZIP8是否構建成功，本研究選擇酶切成功的2號克隆進行測序，測序引物如下。

測序比對結果如圖4所示，表達載體中連接的基因片段序列與SibZIP8基因的CDS序列一致，表明目的基因已成功連接到了表達載體上，超量表達載體構建成功。

3 討論

bZIP轉錄因子能夠參與調控多種植物的生長發(fā)育過程，在植物抵抗逆境脅迫等過程中也起著非常重要的作用[11]。SiZIP基因作為轉錄因子可通過調控下游一些靶基因的表達，在植物逆境脅迫的條件下發(fā)揮作用。YING等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過量表達玉米ZmbZIP72轉錄因子，能夠明顯增強擬南芥對干旱與高鹽脅迫的耐受性。煙草ThpbZIP1和LEA基因的協(xié)同表達，可增強煙草在逆境脅迫下的耐受性。此外，臘梅在脫落酸、高溫、低溫、高鹽和干旱等逆境脅迫下，LEA基因可以誘導表達[13]。BALOGLU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫條件下，黃瓜的某些bZIP基因會表現(xiàn)出下調或者上調的趨勢。

劉寶玲等[15]利用生物信息學的分析方法，系統(tǒng)地分析了谷子SibZIP轉錄因子家族，得到較為完整的谷子bZIP基因家族信息。谷子基因組共編碼75個SibZIP轉錄因子基因，可劃分9個亞家族。其中，SibZIP8基因在谷子各組織中的表達量變化較大。為了探索該基因的功能，本研究構建了SibZIP8基因的超量表達載體，下一步將轉化谷子進行基因功能的驗證?？傊?，本研究結果將為解析bZIP介導的谷子抗旱機制研究奠定理論基礎，為利用轉基因技術提高作物抗逆性提供候選基因。