原料豆粉對兒童營養配方粉儲藏期品質劣變的影響

尋崇榮，王冬梅，吳長玲，王中江，江連洲，李 楊，范志軍

(1黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司，哈爾濱 150036；2東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

嬰兒配方奶粉是為滿足不同市場需求而在生產加工過程中向牛奶中添加各種營養成分，以滿足不同年齡組營養需求的調配奶制品[1]。配方奶粉在室溫下于密封袋或密封罐等厭氧環境中儲存，其保質期通常為12～24個月[2]。研究表明，奶粉品質在儲藏期間劣化的原因非常復雜，可能是物理反應，也可能是脂質氧化和美拉德反應等化學反應引起的風味劣變，或者是影響配方奶粉品質的各種因素相互影響，導致配方奶粉品質劣變[3-4]。產品風味是導致消費者接受程度的重要指標，配方奶粉在儲藏期間會產生不同程度的異味，這些異味成分存在潛在毒性，以減少配方粉營養價值，異味來源可能是由脂肪氧化、蛋白氧化及美拉德反應等產生醛類物質引起[5]。

豆粉中含有豐富的營養物質及大豆低聚糖、大豆異黃酮、大豆卵磷脂等功能性成分，成為兒童營養配方粉的主要原料[6]，故而優先考慮原料豆粉的儲藏期品質失穩對配方粉風味劣變影響規律。豆粉中不飽和脂肪酸的氧化產物主要是氫過氧化物—高活性分子，其生成后迅速分解，產生揮發性及非揮發性化合物組成的復雜混合物，如烴類、醛類和酮類物質，會影響產品的整體質量，另外，這些氧化產物可能與蛋白結合，產生異味成分[4，7]。其中醛類在風味改變和毒理學方面尤為重要[7]。在豆粉制取工藝中的預處理環節中，隨著大豆細胞結構被破壞，多不飽和脂肪酸很容易在脂肪氧合酶的催化下發生脂質過氧化反應，產生自由基和活性次生氧化產物，可能會誘導大豆蛋白氧化。蛋白質氧化是蛋白質分子在ROS直接作用下，或通過次生氧化產物間接作用于蛋白質而導致的蛋白質共價結構修飾。蛋白質氧化是影響食品質量的重要因素，是導致蛋白質營養損失、風味惡化以及功能性質下降的重要原因。鑒于此，本項目分析了蛋白質氧化值變化規律，具體蛋白質氧化值依據羰基含量的測定方法，原理是蛋白在儲藏期間與氧氣、油脂及金屬離子相互作用而形成羰基，主要是N末端連接的α-氨基、賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸及脯氨酸側鏈等發生自由基傳遞反應，導致氨基酸殘基破壞產生羰基(醛基和酮基)[8-9]。隨著儲藏時間不同，原料豆粉的蛋白氧化程度也有差異，可能會形成醛類、酮類等物質以影響配方粉的風味品質，盧靜[9]的研究表明，豆粉在儲藏期間，蛋白羰基含量隨儲藏時間的延長有增加趨勢，說明豆粉中蛋白可能發生了部分氧化。而美拉德產物也可能是豆粉的呈味途徑，美拉德后期產物對豆粉品質有重要影響，故需對不同儲藏期原料豆粉的美拉德產物形成規律進行分析。

目前，制備豆粉最常用的是傳統濕法工藝，其過程一般是將大豆浸泡后進行熱燙、磨漿、分離、煮漿處理，再經濃縮、均質及噴霧干燥制得豆粉[5]。本研究通過分離分級技術抽提不同儲藏期內原料豆粉的油脂、蛋白質等組分，通過研究確定引起兒童營養配方粉風味劣變的可能原因，重點分析豆粉油脂氧化、蛋白氧化及美拉德反應產物對配方粉風味劣變的影響規律，為保持配方奶粉的原始口感、延長貨架期提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆，哈爾濱九三油脂集團；大豆磷脂，周口慧洋飼料有限公司；嬰兒配方粉，黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司；實驗所需基礎試劑均為分析純，北京化學試劑公司。

1.2 儀器

70型漿渣分離磨漿機，沈陽玉祥機械設備有限公司；Ultra-Turrax T25高速分散器，德國IKA公司；噴霧干燥機，無錫昂益達機；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；電熱恒溫水浴鍋，余姚市東方電工儀器廠；酶標儀SH-1000，日本Corona electric公司；RE-205型旋轉蒸發儀，上海予華儀器設備有限公司；高速離心機，德國 Eppendorf 公司。

1.3 豆粉的制備

大豆→浸泡→熱燙→磨漿→漿渣混合物→漿渣分離→豆乳→酶解→滅酶→高壓均質→調配→濃縮→噴霧干燥→豆乳粉。

參照齊寶坤等[6]的方法稱取一定量大豆于燒杯中，用濃度為0.5%的NaHCO3水溶液浸泡10 h左右后用沸水熱燙5 min，按豆水比1∶7的比例添加pH為6.5～7.0的90℃弱堿水進行磨漿得漿渣混合物，然后漿渣分離得豆乳，將分離后的豆乳在95℃下，煮漿20 min，添加2%的乳化劑大豆磷脂進行調配混勻，將調配好的豆乳進行真空濃縮至豆乳固形物含量達15%左右，然后在進口溫度為185℃、出口溫度為85℃條件下進行噴霧干燥即得豆粉，將得到的豆粉進行密封室溫保存。

1.4 兒童營養配方粉的制備

參照夏明敬[12]的方法，將制備的豆粉與購買的嬰兒配方粉原料按照23∶100的比例進行配比并配制成溶液，在進口溫度為180℃、出口溫度為80℃的條件下噴霧干燥，得到兒童營養配方粉，密封室溫保存備用。

1.5 原料豆粉及兒童營養配方粉油脂的提取

采用索氏抽提法利用正己烷與石油醚混合溶劑抽提豆粉及兒童營養配方粉中的油脂，抽提溫度為55℃，抽提油脂與混合溶劑進行旋轉蒸發處理，揮去混合溶劑組分獲取油脂，將抽提出的油脂置于-20℃冰箱避光備用，進行酸價、過氧化值及丙二醛值測試。

1.6 酸價、過氧化值及丙二醛值的測定

參考 GB /T 5530—2005測定酸價；參考GB /T 5538—2005測定過氧化值；參考GB/T 5009.181-2003修正優化測定丙二醛值。

1.7 原料豆粉脂肪氧化酶活性的測定

參考石勝堯[17]等的方法，采用分光光度法對樣品中脂肪氧化酶含量進行測定，準確稱取0.10 g樣品，用5 mL蒸餾水、5 mL硼酸緩沖液溶解于試管中，緩慢振動0.5 h，用濾紙過濾，將濾液定容至50 mL容量瓶。脂肪氧化酶活性為50 000 U/mg，準確稱量0.001 9 g脂肪氧化酶，用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，濃度為0.001 9 g/mL。分別取0、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04 mL脂肪氧化酶加入帶有刻線的試管中，每個試管中加入0.025 mL亞油酸鈉，然后分別用硼酸緩沖液定容至3 mL，用移液槍取20 μL，于酶標儀在234 nm處測定酶反應的吸光值，每0.5 h記錄1次吸光值，得到OD變化的最大值，以脂肪氧化酶濃度為橫坐標，ΔOD/min值為縱坐標，作出脂肪氧化酶標準曲線(圖1)。

取0.01 mL大豆提取液，加入0.025 mL亞油酸鈉，用pH為9.0的硼酸緩沖液定容至3 mL。用移液槍取20 μL，酶標儀在234 nm處測定酶反應的吸光值，每0.5 h記錄1次吸光值，得到OD變化的最大值。樣品中的脂肪氧化酶活性按式(1)計算：

(1)

式(1)中，X-樣品中脂肪氧化酶活性(U/mg)；M-脂肪氧化酶濃度(μg/mL)；m1-樣品的質量(μg)；V1-樣品稀釋的體積(mL)；V2-測量時取的樣品稀釋液的體積(mL)；V3-硼酸溶液定容后的體積(mL)。

1.8 原料豆粉及兒童營養配方粉蛋白的提取

參照李淑芬等[10]的方法，將豆粉及兒童營養配方粉用正己烷進行脫脂處理，然后用堿溶酸沉法提取脫脂豆粉中的蛋白，冷凍干燥后于4℃保存備用。

1.9 羰基含量的測定

參照盧靜[9]和Levine[11]等的方法，測定樣品蛋白中的羰基含量。

(2)

1.10 采用OPA法追蹤豆粉的美拉德產物

參考劉振春等[21]的方法，準確稱取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中，再加入20%(w/w)的十二烷基硫酸鈉(SDS)2.5 mL、硼砂(0.1 mol/L)25.0 mL、β-巰基乙醇100 μL，最后用蒸餾水定容到50 mL。測定時，取4.0 mL OPA試劑于試管中，加入200 μL樣品，混合均勻，放入35℃水浴中反應2 min后在340 nm下測吸光值A340，另取4.0 mL OPA試劑于試管中，加入200 μL水作為空白對照。接枝度可以用式(3)計算：

DG(%)=[(A0-A1)/A0]×100

(3)

式(3)中,A0：接枝反應前溶液的吸光值；A1：接枝反應后溶液的吸光值。

1.11 數據處理

每組試驗都進行3次平行試驗，并將試驗數據進行誤差分析。采用統計學軟件SPSS 18對試驗數據進行方差分析、相關性和差異顯著性分析；采用Origin 8.5軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同儲藏期原料豆粉及兒童營養配方粉油脂氧化程度變化規律

2.1.1儲藏時間對原料豆粉及兒童營養配方粉酸價的影響 酸價是評價油脂氧化過程中產生酸性物質量的一個有效指標，酸價可以作為評價其氧化程度的敏感指標之一[13]。由圖2可知，儲藏時間不超過8個月時，原料豆粉及兒童營養配方粉的油脂酸價隨儲藏時間的延長有增加趨勢，但變化不明顯(P>0.05)，表明8個月儲藏期內原料豆粉及兒童營養配方粉的油脂氧化程度相對較低；儲藏時間超過8個月后，油脂酸價隨儲藏時間的延長顯著增加(P<0.05)，可見長期儲藏時，原料豆粉及兒童營養配方粉中的油脂組分均發生了“氧化”現象。對比兒童營養配方粉與其原料豆粉可知，隨著儲藏時間的延長，兩種樣品的酸價變化趨勢相同，說明原料豆粉對兒童營養配方粉的油脂氧化有一定作用；儲藏時間超過8個月時，兒童營養配方粉提取油脂的酸價高于原料豆粉，原因可能是兒童營養配方粉輔料部分催化了油脂的氧化作用，其中ZnO屬于高活性氧化催化劑，以致相同儲藏期內，兒童營養配方粉的酸價較高。兒童營養配方粉配料中的維族元素具有一定的抗氧化性，但酸價仍然較高于原料豆粉，原因可能是輔料中全脂乳粉的油脂發生了氧化，進而影響整體風味[14-15]。

圖1 脂肪氧化酶標準曲線

圖2 儲藏時間對原料豆粉及兒童營養配方粉酸價的影響

圖3 儲藏時間對原料豆粉及兒童營養配方粉過氧化值的影響

2.1.2儲藏時間對原料豆粉及兒童營養配方粉過氧化值的影響 由圖3可知，隨著儲藏時間的延長，油脂過氧化值整體呈現逐漸增大的變化趨勢，說明原料豆粉及兒童營養配方粉隨著儲藏期的延長均出現了緩慢的自動氧化作用；且兩者的過氧化值隨儲藏時間的延長有相同的變化趨勢，說明兒童營養配方粉在儲藏過程中的品質劣變與原料豆粉油脂氧化有一定的相關性。儲藏8個月的原料豆粉樣品的油脂氧化值較高，此結果部分證實了油脂氧化是風味劣變的可能原因[16]。儲藏時間超過6個月時，兒童營養配方粉提取油脂的氧化值顯著高于原料豆粉樣品，此結果進一步證實了酸價分析中的推論。由于相同儲藏時間內植物油脂過氧化值應低于動物油脂，因此，本結果中兒童營養配方粉中油脂的過氧化值高進一步證實了全脂乳粉可能發生了較大程度氧化，并誘導了豆粉中油脂的氧化。

2.1.3儲藏時間對原料豆粉及兒童營養配方粉丙二醛生成量的影響 由圖4可知，儲藏時間不超過4個月時，原料豆粉及兒童營養配方粉的丙二醛生成量變化不明顯，說明短期儲藏不會影響樣品的品質劣變；儲藏期延長到6個月時，原料豆粉的丙二醛含量增加不明顯，但兒童營養配方粉的丙二醛生成量顯著增加，說明兒童營養配方粉中的全脂乳粉發生了氧化，導致兒童營養配方粉的丙二醛生成量較高。儲藏時間超過6個月后，原料豆粉及兒童營養配方粉丙二醛含量顯著增加(P<0.05)，說明長期儲藏時，豆粉油脂逐步氧化形成過多的氧化終產物，丙二醛含量增加，一定程度上導致兒童營養配方粉氧化程度增加，丙二醛含量增多，且相同儲藏期內兒童營養配方粉的丙二醛含量相對較高，原因是植物性油脂氧化產生的丙二醛量較動物性油脂少，兒童營養配方粉中的全脂乳粉可能繼續發生氧化，以致兒童營養配方粉的丙二醛生成量較高。儲藏期8個月時，原料豆粉的丙二醛生成量增幅最大，原因可能是8個月左右的儲藏期是原料豆粉末端氧化發生的重點時期，也是“氧化味”產生的主要時期。

2.1.4儲藏時間對原料豆粉及兒童營養配方粉脂肪氧化酶活性的影響 由圖5可知，隨著儲藏時間的延長，原料豆粉及兒童營養配方粉中的脂肪氧化酶活性并未發生顯著變化。說明原料奶粉及兒童營養配方粉風味劣變的原因并非源自酶促氧化，結合脂肪氧化程度結果分析可知，品質劣變可能是由脂肪的自動氧化引起，在長期儲藏下，原料豆粉及兒童營養配方粉的脂肪氧化程度逐漸增大，可能與脂肪氧化的鏈式反應有關[18-19]，油酸、亞油酸、亞麻酸氧化產生醛類物質及氫過氧化物，這些物質經過裂解產生己醛，進一步反應會導致原料豆粉及兒童營養配方粉風味劣化[15]。

2.2 不同儲藏期原料豆粉及兒童營養配方粉蛋白氧化程度的變化規律

由附表可知，原料豆粉及兒童營養配方粉的蛋白質羰基含量隨儲藏時間的延長有增加趨勢，但變化不明顯。由劉晶[20]的研究結果可以看出，丙二醛含量增加會引起大豆蛋白羰基含量增加，說明原料豆粉及兒童營養配方粉的脂肪氧化可能促進蛋白的氧化，以致蛋白羰基含量增加，但蛋白羰基含量在儲藏期間變化不明顯，說明蛋白氧化并非是影響兒童營養配方粉風味劣變的主要原因。

附表 蛋白氧化程度結果

2.3 不同儲藏期原料豆粉及兒童營養配方粉美拉德產物的形成規律

接枝度的高低反映了美拉德反應產物形成的多少，接枝度較高，表明樣品發生美拉德反應的程度較強。由圖6可知，原料豆粉及兒童營養配方粉的接枝度隨儲藏時間的延長有增加趨勢，但變化不明顯，說明美拉德反應對原料豆粉及兒童營養配方粉品質劣變的影響較小。通過對比發現，原料豆粉與兒童營養配方粉在加工過程中美拉德產物形成差異不明顯，說明儲藏期間兒童營養配方粉發生的美拉德反應主要是由原料豆粉引起的。

圖4 儲藏時間對原料豆粉及兒童營養配方粉丙二醛生成量的影響

圖5 儲藏時間對原料豆粉及兒童營養配方粉脂肪氧化酶活性的影響

圖6 儲藏時間對原料豆粉及兒童營養配方粉美拉德反應的影響

3 結論

本文對不同儲藏期間兒童營養配方粉及其原料豆粉的油脂及蛋白成分進行了研究，通過油脂的過氧化值、酸價、丙二醛含量分析不同儲藏期的油脂氧化程度；采用分光光度法對脂肪氧化酶活性進行測定；通過羰基含量的測定，確定不同儲藏期內樣品的蛋白氧化程度；采用OPA法豆粉追蹤美拉德產物，確定美拉德反應產物對配方粉風味劣變的影響。結果發現，儲藏期間原料豆粉及兒童營養配方粉的品質劣變主要是由油脂自動氧化引起的，蛋白質氧化和美拉德反應對原料豆粉及兒童營養配方粉品質劣變影響較小；且原料豆粉與兒童營養配方粉的油脂氧化變化趨勢相同，對兒童營養配方粉的品質劣變有一定促進作用，但全脂乳粉可能也對兒童營養配方粉的油脂氧化變質有一定作用。◇