山東省鴨類感染豬圓環病毒3型的初步調查

劉玉偉 辛長勛 王碩 高梅 鄭書軒 時建立 彭喆 吳曉燕 王金寶 李俊

摘要：2016年，美國學者首次從患有皮炎腎病綜合征和繁殖障礙母豬體內檢測到一種新發的豬圓環病毒，命名為豬圓環病毒3型（Porcine circovirus 3，PCV3）。山東省豬群已檢測出PCV3陽性感染，而對于山東省鴨類PCV3的感染情況未有報道。本研究采用PCR檢測方法，對山東省鴨場采集的146份樣品進行PCV3檢測，檢出陽性率為零，表明山東省鴨類不存在PCV3感染。

關鍵詞：豬圓環病毒3型；鴨；PCR；山東省

中圖分類號：S858.322.65+9.5文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）05-0126-03

Abstract In 2016， a new type of porcine circovirus named as Porcine circovirus 3 （PCV3） from sows with dermatitis-nephritic syndrome and reproductive failure was first reported in America. PCV3 has been detected in sows and live-born infants in Shandong Province. However， the infection of PCV3 in ducks has not been reported. In this study， 146 samples were collected from duck farms in Shandong Province. The samples were tested by PCV3 PCR. The results showed zero positive. In conclusion， there was no PCV3 infection in ducks in Shandong Province.

Keywords Porcine circovirus 3； Duck； PCR； Shandong Province

豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）是單股閉合環狀DNA 病毒，粒子直徑平均為17 nm，無囊膜，是目前已報道的最小的動物類病毒[1]。豬圓環病毒是圓環病毒屬的代表種，根據其致病性、抗原性及核苷酸序列的差異性，將其劃分為豬圓環病毒1型（PCV1）、豬圓環病毒2型（PCV2）和豬圓環病毒3型（PCV3）。

PCV1不產生細胞病變，不會引起豬的發病[2]。PCV2可引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征[3]，同時還與母豬繁殖障礙[4]、豬皮炎與腎病綜合征[5]、豬壞死性及增生性肺炎[6]等疾病密切相關。世界各地規模化豬場普遍存在PCV2感染，給全球養豬業造成的危害不可估計。

2016年，美國學者首次發現并報道了PCV3[7]。目前，山東省豬群已檢測出PCV3陽性感染[8，9]。有報道稱，中國的犬類也檢測出PCV3陽性感染[10]。山東省作為中國的養鴨大省，鴨類是否感染PCV3尚未報道。為了解山東省鴨群PCV3的情況，本研究從山東省6個鴨場隨機采集146份樣品，采用PCR檢測方法進行PCV3檢測，以期為山東省鴨類是否受PCV3的威脅提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在山東省的6個鴨場隨機采集116份血清和30份組織樣品（淋巴結、脾臟、肺臟）。

1.2 主要試劑與儀器

10%十二烷基硫酸鈉（SDS）、蛋白酶K、Tris飽和酚均購自北京Solarbio公司；無水乙醇、70%乙醇和三氯甲烷均購自國藥集團化學試劑有限公司；雙蒸水購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DL-2000 DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司；2×Taq PCR StarMix購自上海起發實驗試劑有限公司。

組織裂解器購自德國QIAGEN公司；DK-8D型電熱恒溫水槽購自上海精宏實驗設備有限公司；移液槍和臺式離心機均購自德國Eppendorf公司；PTC-2000型PCR儀購自美國MJ Research公司；凝膠成像儀購自Alpha Innotech公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設計 根據 GenBank公布的PCV3 基因序列，在其高度保守區域，利用Primer Premier 5.0軟件輔助設計一對特異性引物，擴增片段為330 bp。由生工生物工程（上海）股份有限公司負責合成引物。引物序列見表1。

1.3.2 DNA提取 根據《動物病毒學》[11]，采用SDS-蛋白酶K法提取DNA。

1.3.3 PCR擴增 將提取的DNA進行PCR擴增。擴增反應采用20 μL體系，依次在反應管中加入2×Taq PCR StarMix 10 μL、PCV3-F 1 μL、PCV3-R 1 μL、DNA模板1 μL，最后加雙蒸水至體積為20 μL。同時設立陰性對照和陽性對照。

反應程序為：94℃預變性4 min；94℃變性20 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環；最后72℃延伸5 min。PCR反應結束后，取出5 μL產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。剩余產物保存于4℃。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

利用所設計的PCV3引物對陰、陽性樣品進行PCR擴增。圖1所示， PCV3陽性樣品可擴增出1條約330 bp條帶，與預期片段大小相符；陰性樣品無條帶。

2.2 臨床樣品檢測結果

圖2為部分樣品PCV3檢測結果。 146份臨床樣品均為PCV3陰性，陽性率為零。由于本次調查僅選取山東省內6個鴨場且在冬季進行檢測，氣溫較低且穩定，使得鴨群疾病發生率較低，所以調查結果可能存在一定的片面性與局限性，更加全面有效的PCV3感染情況有待于進一步的調查研究。

3 討論與結論

自2016年美國首次發現并報道PCV3以來，中國等國家豬群相繼檢測出PCV3陽性感染，給全球養豬業造成的損失不容忽視。隨著中國犬類感染PCV3的報道，PCV3的陽性感染與防控得到越來越多的關注與重視。目前，對于PCV3的研究還處于初級階段，市場嚴重缺乏針對性的疫苗和藥物。鑒于PCV3存在傳播速度快、途徑多、范圍廣的特征，今后在飼養過程中需要更加重視PCV3的研究和監控工作。首先，豬場需要加強生物安全體系，提高飼養管理水平，增強豬群免疫力，切斷病毒和有害細菌傳播途徑；其次，加快開展相關檢測技術的研究，建立PCV3快速、靈敏、特異的血清學檢測方法及相關檢測技術，如利用膠體金免疫層析技術制備PCV3抗原檢測試紙條等，對出入口岸農畜產品進行PCV3快速篩查；最后，分離與鑒定 PCV3毒株，進而開展疫苗研發與動物回歸試驗，為我國養殖業的健康發展保駕護航。

山東省鴨類養殖規模較大，目前尚無山東省鴨群存在PCV3陽性感染的報道。本次調查沒有檢測出山東省鴨類PCV3的陽性感染，初步表明，目前山東省鴨類不存在PCV3感染，說明PCV3對山東省鴨群暫時沒有造成威脅。推測PCV3主要在哺乳動物體內引起感染，鳥類不會感染此病毒。

參 考 文 獻：

[1] Tischer I， Gelderblom H， Vettermann W， et al. A very small porcine virus with circular single-stranded DNA[J]. Nature， 1982， 295（5488）：64-66.

[2] Tischer I， Mields W， Wolff D， et al. Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus[J]. Arch. Virol.， 1986， 91（3/4）： 271-276.

[3] Baekbo P， Kristensen C S， Larsen L E. Porcine circovirus diseases： a review of PMWS[J]. Transbound Emerg. Dis.， 2012， 59（S1）： 60-67.

[4] Karuppannan A K， Ramesh A， Reddy Y K， et al. Emergence of porcine circovirus 2 associated reproductive failure in Southern India[J]. Transbound Emerg. Dis.，2016， 63（3）： 314-320.

[5] Allan G M， McNeilly E， Kennedy S， et al. PCV-2-associated PDNS in Northern Ireland in 1990. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome[J]. Vet. Rec.， 2000， 146（24）：711-712.

[6] Szeredi L， Szentirmai C. Proliferative and necrotising pneumonia and severe vascular lesions in pigs naturally infected with porcine circovirus type 2[J]. Acta Vet. Hung.， 2008， 56（1）： 101-109.

[7] Pallnski R， Pieyro P， Shang P， et al. A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J]. J. Virol.， 2016， 91（1）： e01879-16.

[8] 劉曉東，楊旭兵，鄭慶禮，等. 我國部分省（區）豬圓環病毒3型的分子流行病學研究[J]. 動物醫學進展， 2017，38（11）：18-21.

[9] Zheng S X， Wu X Y， Zhang L L， et al. The occurrence of porcine circovirus 3 without clinical infection signs in Shandong Province[J]. Transbound Emerg. Dis.， 2017， 64（5）：1337-1341.

[10]Zhang J X， Liu Z G， Zou Y W， et al. First molecular detection of porcine circovirus type 3 in dogs in China[J]. Virus Genes，2018，54（1）：140-144.

[11]殷震，劉景華. 動物病毒學[M]. 第2版. 北京： 科學出版社， 1997： 681-688.