耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌cprD基因突變分析及耐藥元件研究

陳彩云，吳慶，賴紅娟

耐碳青霉烯類藥物的細菌菌株是耐藥程度較為嚴重的菌株，其不僅對碳青霉烯類藥物表現為耐藥，同時對青霉素及頭孢一代至四代藥物也表現為耐藥。耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌的原因往往為菌株生產具有對碳青霉烯類藥物有水解活性的 -內酰胺酶和/或菌株自身的膜孔蛋白D基因發生突變相關[1]。近年來，盡管國內有較多關于鮑氏不動桿菌耐藥基因（耐藥機制）的報道，但涉及鮑氏不動桿菌D基因突變的研究較為罕見[2-4]。因此筆者收集了一組耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌，對其進行了D基因突變分析和 33種B-內酰胺類藥物耐藥基因，16種氨基糖苷類藥物耐藥基因和 10種可移動遺傳元件（MGEs）檢測，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 細菌來源 收集2015年 1月至2017年12月浙江省泰順縣人民醫院住院患者痰標本分離的菌株20株。

1.2 菌種鑒定和藥敏試驗 菌株鑒定采用法國梅里埃公司 VITEK2compact細菌鑒定儀，抗菌藥物藥敏試驗梅里埃公司 VITEK2compact細菌鑒定儀和Kirby-Bauer紙片擴散法。

1.3 細菌DNA制備 為蛋白酶K水解裂解法，試劑盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。

1.4 基因檢測 全部耐藥基因檢測均為聚合酶鏈式反應（PCR）法，檢測項目：膜孔蛋白 oprD基因和32種 B-內酰胺酶基因，共 33種B-內酰胺類藥物耐藥基因，16種氨基糖苷類藥物耐藥基因，10種MGEs。全部PCR引物由無錫新吳區新克隆數據分析工作室設計并獲授權使用，PCR擴增盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。

1.6 菌株間親緣關系分析 測得結果作樣本聚類分析（UPGMA法）。樣本聚類分析由無錫新吳區新克隆數據分析工作室完成。

2 結果

2.1 抗菌藥物敏感性試驗結果 20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌不僅對碳青霉烯類藥物（亞胺培南、美洛培南）表現為耐藥，對第三、第四代頭孢及復合制劑亦表現為耐藥，12種抗菌藥物的耐藥率均為100.0%。見表1。

2.3 耐藥元件檢測結果 20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌D突變率達100.0%；另外 TEM、 ADC、OXA-23 群、 OXA-66、’-Ⅰb、3’-Ⅰ、 Ⅰ1、ISaba1的檢出率亦均達100.0%。見表2。

2.4 親緣關系分析 20株菌有明顯的聚集性，且有3個克隆播散，見圖1。

3 討論

抗菌藥物敏感性試驗結果顯示，20株菌不僅對碳青霉烯類藥物均表現為耐藥，對第三、第四代頭孢及復合制劑亦均表現為耐藥。對D基因作PCR擴增及DNA測序，20株菌測得序列一致。將測得DNA序列轉為氨基酸序列后獲得一條長438個氨基酸殘基的序列，經與SDF株比對，有4個氨基酸殘基序列不同，即20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌D突變率達100.0%。序列決定結構，結構決定功能，序列改變將導致功能改變。另外，20株菌 TEM、 ADC、OXA-23群、 OXA-66等4種 -內酰胺酶基因均為 100.0%檢出率。因此可以推測本文菌株耐上述 -內酰胺類藥物是菌株D突變與同時攜帶4種 -內酰胺酶基因的合力結果。

表1 20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌對抗菌藥物耐藥情況 %

表2 20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌耐藥元件檢測結果 株（%）

本文菌株對3種氨基糖苷類藥物均表現為耐藥，20 株菌 2’-Ⅰb、3’-Ⅰ等2種氨基糖苷類藥物耐藥基因檢出率均為100.0%；另外， (3)-Ⅰ、 (6′)-Ⅰb、 (3”)-Ⅰ、 A等4種氨基糖苷類藥物耐藥基因檢出率均在75.0%以上。這些就是導致耐氨基糖苷類藥物的原因。

本組20株菌有明顯的聚集性，且有3個克隆播散。2號株、4號株、5號株、6號株、8號株、9號株、10號株、11號株、12號株、14號株、16號株、17號株等12株為第1個克隆[均存在oprD突變與攜帶 TEM、 ADC、 OXA-23群、OXA-66、 2’-Ⅰb、 (3)-Ⅰ、 (6’)-Ⅰb、 (3”)-Ⅰ、3’-Ⅰ、 A、1U513、ISaba1、IS26]；1 號株、18號株、20號株等3株為第2個克隆（均存在D突變與攜帶 TEM、ADC、 OXA-23群、 OXA-66、2’-Ⅰb、 (3)-Ⅰ、 (6’)-Ⅰb、(3”)-Ⅰfffcc03’-Ⅰ、fffcbfⅠ1、fffcbeU、fffcbd513、ISaba1、IS26)；3號株、6號株為第3個克隆(均存在oprD突變與攜帶 TEM、ADC、fffcbcOXA-23 群、fffcbbXA-66、fffcbaⅠb、fffcb93’-Ⅰ、fffcb8Ⅰ1、fffcb7U、fffcb6513、ISaba1、IS26)。可見這 3 個克隆的菌株均為攜帶了多種 -內酰胺類藥物耐藥基因、多種氨基糖苷類藥物耐藥基因和多種MGEs。

圖1 20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌菌株耐藥元件檢測結果的樣本聚類分析