半枝蓮提取物對小鼠Ⅱ型膠原誘導性關節炎的治療作用

彭勇，龔瓊瑤，鄒榮鑫，黃海燕，應穎，耿保慶，陳勇

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物，具有抗炎癥、免疫調節、解熱、抗腫瘤、抗菌及抗氧化等藥理作用[1]。半枝蓮提取物具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用[2]，還具有抗炎癥及免疫調節的作用[3]。類風濕關節炎（RA）系一種以關節滑膜炎為特征的自身免疫性疾病。活化的RA成纖維樣滑膜細胞（FLS）在RA炎癥的發生和發展過程中起著至關重要的作用，其具有異常增殖、遷移和浸潤等類似腫瘤細胞樣的生物學特性[4]。此外，RA患者的血清和炎癥關節中存在著大量的炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-（TNF-）、白細胞介素-1（IL-1 ）、白細胞介素-6（IL-6）及白細胞介素-33（IL-33）等，這些炎癥因子參與RA關節炎癥反應及關節破壞的進程。因此，本研究通過研究半枝蓮提取物對CIA小鼠模型關節炎癥狀況、關節組織病理學變化情況及血清細胞因子的表達水平等指標的影響，探討其對RA小鼠的治療作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物 SPF級近交系DBA/1小鼠，6～8周齡，雄性，體質量18～20 g，購自于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號：SCXK(滬)2012-0002，合格證編號：2007000564939]，于寧波大學醫學院SPF級動物實驗房飼養。本實驗嚴格遵守單位機構動物倫理學委員會的倫理學指南進行。

1.2 實驗材料 半枝蓮提取物購自南京澤朗醫藥科技有限公司，完全弗氏佐劑（CFA）和不完全弗氏佐劑（FA）均為sigma公司產品，牛Ⅱ型膠原蛋白（CII）為Chondrex公司產品，ELISA試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司。

1.3 構建RADBA/1小鼠模型及分組訂購100只SPF級DBA/1小鼠，SPF級飼養1周，讓小鼠熟悉環境；對小鼠進行編號，并隨機分為5組：完全對照組、0.9%氯化鈉注射液對照組以及半枝蓮低、中、高劑量治療組，每組20只。完全對照組不作任何處理。其他組小鼠建立CIA模型：將2 mg/ml CII與1 mg/ml CFA等體積在冰浴中混合、乳化。于每只小鼠尾根部皮下注射150 l該乳化劑進行造模，并記為造模第0天。造模第21天，將CII與CFA等體積混合、乳化，再次將該乳化劑150 l注射于小鼠尾根部皮下，強免疫1次。

1.4 給藥觀察 造模第22天開始造模小鼠灌胃給藥：半枝蓮低、中、高劑量治療組分別通過灌胃給予半枝蓮提取物30、60、90mg/次（用 0.9%氯化鈉注射液配制），0.9%氯化鈉注射液對照組及完全對照組，同步0.9%氯化鈉注射液灌胃。每天1次，連續21 d。分別于造模第28和49天進行小鼠關節炎癥狀況評價：前后抓足掌厚度測定和關節炎評分兩方面。關節炎評分標準：正常為0分；輕微的但有明確的發紅和腕關節或踝關節發炎為1分；中等程度的發紅和腕關節或踝關節發炎為2分；整個爪子包括腳趾嚴重的發紅發炎記為3分：涉及多關節，四肢的最大程度的紅腫、關節變形、功能損傷為4分[5]。四只爪子得分相加為小鼠關節炎總評分。

1.5 血清內細胞因子檢測 造模第49天摘眼球取血1 ml，分離血清，檢測各組小鼠血清IL-1 、IL-6、IL-33、TNF-和白細胞介素-1受體拮抗劑（IL-1Ra）的水平。

1.6 關節病理切片的制備 于造模第49天取小鼠左、右后肢，剔除皮毛及結締組織，保留肌肉組織，浸泡在4%甲醛溶液中進行組織固定，石蠟包埋，切片，HE染色，封片，病理分析，對于關節病理進行半定量評分。每個關節的半定量評分標準：0分，關節結構正常；1分，輕度的關節炎癥并有滑膜增生，血管數量增加，以及小的炎癥細胞灶，無軟骨和骨的侵蝕破壞；2分，關節有軟骨的侵蝕破壞，中度的關節炎癥，大量的炎癥細胞浸潤，滑膜細胞增生、血管翳形成較嚴重，骨和關節結構無破壞；3分，有嚴重的血管翳形成，廣泛的軟骨侵蝕破壞，可見骨破壞，關節結構破壞[5]。兩只后肢得分相加為小鼠關節病理總評分。

1.7 統計方法 采用SPSS18.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-法；兩組比較采用 檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIA小鼠關節炎模型的建立 在造模第14天首次觀察到小鼠發病，第28天左右小鼠大規模發病，建模成功的CIA小鼠的足趾關節較對完全對照組小鼠的明顯紅腫。

2.2 小鼠關節炎癥狀況評價檢測 造模第28天，4組造模組小鼠的足掌厚度明顯高于完全對照組（均＜ 0.05），各造模組小鼠的足掌厚度差異無統計學意義（＞0.05）。造模第49天，4組造模組小鼠的足掌厚度明顯高于完全對照組（均＜0.05），中、高劑量半枝蓮治療組小鼠的足掌厚度低于 0.9%氯化鈉注射液對照組（均＜0.05）。見表1。造模第28天，4組造模組小鼠的關節炎評分差異無統計學意義（＞0.05）；造模第49天，中、高劑量半枝蓮治療組小鼠的節炎評分低于0.9%氯化鈉注射液對照組及半枝蓮低劑量治療組（均＜ 0.05）。見表 2。

2.3 血清內細胞因子檢測 造模第49天，0.9%氯化鈉注射液對照組小鼠血清中炎癥因子IL-1 、IL-6、IL-33、TNF- 及抑炎因子 IL-1Ra的水平均高于完全對照組小鼠（均＜0.05)。半枝蓮低劑量治療組小鼠血清中炎癥因子IL-1、IL-6及IL-33的表達水平與0.9%氯化鈉注射液對照組差異均無統計學意義（均＞0.05），TNF-水平低于0.9%氯化鈉注射液對照組（＜0.05），IL-1R 高于0.9%氯化鈉注射液對照組（＜0.05)。半枝蓮中、高劑量治療組小鼠血清中炎癥因子IL-1 、IL-6、IL-33、TNF- 表達水平均低于0.9%氯化鈉注射液對照組（均＜0.05），半枝蓮高劑量治療組低于半枝蓮中劑量治療組（均＜0.05）。半枝蓮低、中、高劑量治療組小鼠血清中抑炎因子IL-1Ra的水平均高于完全對照組及0.9%氯化鈉注射液對照組（均＜0.05）。見表3。

2.4 病理結果分析 完全對照組小鼠關節結構正常（封三彩圖8A），病理評分為0分。0.9%氯化鈉注射液對照組小鼠關節呈現典型RA表現，可見大量滑膜細胞增生、炎性細胞浸潤及血管翳形成，見廣泛的軟骨和骨侵蝕破壞，關節正常生理結構消失，關節面融合（封三彩圖8 B）。半枝蓮提取物低劑量治療組與0.9%氯化鈉注射液對照組僅關節間隙有所改善（封三彩圖8C），病理評分與0.9%氯化鈉注射液對照組差異無統計學意義（＞0.05）。半枝蓮提取物中劑量治療組小鼠關節間隙仍有狹窄，可見大量的炎癥細胞浸潤，滑膜細胞增生、血管翳形成較嚴重，可見軟骨的侵蝕破壞，但骨和關節結構存在（封三彩圖8D），病理評分較0.9%氯化鈉注射液對照組改善（＜0.05）。半枝蓮提取物高劑量治療組小鼠關節腔結構基本正常，未見明顯骨質破壞及血管翳形成，可見輕度炎性細胞浸潤、滑膜增生，僅部分關節可見軟骨輕微侵蝕破壞（封三彩圖8E），病理評分較0.9%氯化鈉注射液對照組改善（＜0.05）。見表 4。

表1 各組小鼠足掌厚度比較 cm

表2 各組小鼠關節炎評分比較 分

表3 各組小鼠血清中細胞因子檢測結果比較 pg/ml

3 討論

RA是一種由多種免疫細胞參與的全身性自身免疫性疾病，最終將導致關節軟骨和骨的破壞。目前對于RA發病機制并不十分清楚，其基本病理表現為滑膜炎，FLS在RA的滑膜異常增生及骨侵蝕中起著關鍵性作用[6]。FLS類似腫瘤細胞樣的生物學特性表現為異常增殖、遷移和浸潤及抗凋亡[7]；此外，還有調節炎性因子分泌的作用，如調節TNF-、IL-1、IL-6和IL-13等細胞因子[8]。這些炎癥因子是 RA 發病機制中重要的炎性因子[9]。IL-1Ra與IL-1受體結合后抑制IL-1信號復合物的形成，是一個重要的負性調節[10]，在RA中起到一定程度的保護作用。

半枝蓮及其提取物均具有良好的抗腫瘤活性且療效確切。Jiang等[11]研究發現，半枝蓮可以通過下調IL-6表達水平，抑制人結腸癌細胞的STAT3信號通路，最終抑制人結腸癌細胞的異常增殖并促進其凋亡，達到抗腫瘤作用。在肺癌小鼠實驗中發現，半枝蓮可顯著抑制荷瘤小鼠血清中IL-17、IL-10和IL-6表達水平，上調IL-2和干擾素-（IFN-）水平，并通過調節荷瘤小鼠的免疫功能而抑制體內腫瘤生長[12]。此外，有研究還發現，給予半枝蓮治療的糖尿病小鼠，其視網膜中TNF-和IL-1的mRNA表達水平及血清中TNF-和IL-1表達水平均受到顯著抑制，半枝蓮通過預防糖尿病小鼠的視網膜炎癥進而防止糖尿病視網膜病變[13]。本研究發現，中、高劑量半枝蓮提取物可有效減輕 CIA小鼠關節腫脹程度，有效改善小鼠關節炎評分，并呈現劑量依賴性。同時還發現半枝蓮提取物可顯著抑制 CIA小鼠血清中炎癥因子IL-1、IL-6、IL-33、TNF-的表達水平，同時上調了炎癥負性調節IL-1Ra表達水平，同樣呈現了劑量依賴性。本研究還發現：中、高劑量半枝蓮提取物可降低CIA小鼠關節病理評分，可有效減輕CIA小鼠關節滑膜細胞增生、炎性細胞浸潤及血管翳形成，延緩關節軟骨和骨侵蝕破壞，保護小鼠關節正常生理結構，總體改善CIA小鼠關節病理情況，與關節炎評價中足掌厚度結果、關節炎評分結果一致。

綜上所述，半枝蓮提取物可有效地減輕CIA小鼠關節炎癥，改善CIA小鼠關節病理情況，對RA小鼠具有治療作用，其作用機制可能是通過抑制IL-1、IL-6、IL-33、TNF- 等炎癥因子表達，并上調抑炎因子IL-1Ra的水平來實現的。但本文也僅初步探討研究了半枝蓮提取物對CIA小鼠的治療作用，其具體作用機制尚不清楚，這有待進一步研究。

表4 各組小鼠關節病理評分結果比較 分