九站地區(qū)根際土壤高效解磷菌的篩選及分類鑒定

張夢(mèng)坤 張欣 周星 孫亞靜

【摘 要】 采用無機(jī)磷固體培養(yǎng)基從九站地區(qū)實(shí)驗(yàn)田玉米根際土壤中分離篩選出一株高效解磷菌jl-3，在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基中，初始pH值為7.0，溫度30℃培養(yǎng)3天，通過對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定，鑒定其為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。無機(jī)磷液體培養(yǎng)基培養(yǎng)利用磷鉬藍(lán)比色法測(cè)得在第6天時(shí)可溶性磷含量最多。

【關(guān)鍵詞】 九站地區(qū)；解磷菌；解磷能力；陰溝腸桿菌

[Abstract] The inorganic phosphorus solid medium from nine station area field separation in maize rhizosphere， an efficient phosphate-solubilizing bacteria jl - 3， in the inorganic phosphorus in the solid medium， the initial pH value of 7.0， temperature 30 ℃ training three days， through carries on the morphology observation， physiological and biochemical test and molecular biology identification， identification of the sewer enterobacteriaceae （Enterobacter cloacae）. Phosphorus molybdenum blue colorimetry was used to determine the most soluble phosphorus content in the 6th day.

[Key words] nine stations； phosphate-solubilizing bacteria； phosphorus removal capacity； enterobacter cloacae

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。土壤中平均含磷量只有0.05%，只有0.1%能被植物吸收，我國(guó)74%耕地土壤缺乏有效磷，所以土壤有效磷的缺乏是限制植物生長(zhǎng)的主要因素之一[2，3]。解磷微生物是一類能夠?qū)⒅参镫y以吸收的磷轉(zhuǎn)化為可利用狀態(tài)的微生物。磷是許多發(fā)展中國(guó)家農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重要的限制因素，提高土壤中磷的利用效率將具有戰(zhàn)略性意義[4-6]。不同的作物其根際分布的解磷菌種群也有差異[7]，東北地區(qū)的玉米產(chǎn)量占全國(guó)40%以上。本研究結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際土壤情況和解磷菌的重要作用，擬從當(dāng)?shù)赜衩赘H土壤樣品中分離出篩選出高效解磷菌，并對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，為后期培養(yǎng)參數(shù)研究、解磷的條件優(yōu)化及復(fù)合菌劑的開發(fā)提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

土樣：九站地區(qū)玉米根際土樣。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.0g，酵母提取物5.0g，氯化鈉20.0g，蒸餾水1000mL，pH：7.0。

無機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g，瓊脂15.0g，七水硫酸鎂0.25g，磷酸鈣10.0g氯化鎂5.0g，氯化鉀0.3g，硫酸銨0.5g，七水硫酸鐵0.03g，四水硫酸錳0.03g，蒸餾水1000mL，pH：7.0。

無機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g，硫酸銨0.5g，氯化鎂5.0g，氯化鉀0.3g，七水硫酸鎂0.25g，四水硫酸錳0.03g，磷酸鈣10.0g，蒸餾水1000mL，pH：7.0。

1.3 試驗(yàn)方法

（1）富集培養(yǎng)：從玉米根際取1g土樣加入到100mL LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中以初始pH值為7.0、溫度30℃、160r/min培養(yǎng)72h。

（2）菌株初篩：吸取1mL富集培養(yǎng)液，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，將10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9度的稀釋液各取100μL，涂布于無機(jī)磷培養(yǎng)基平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。挑選溶磷圈明顯的菌落進(jìn)一步分離分化，取菌落長(zhǎng)勢(shì)良好、形態(tài)穩(wěn)定的菌株。

（3）菌株復(fù)篩：將初篩得到的出發(fā)菌株接入到無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，裝液量100mL/250mL，置于搖床并以30℃、160r/min培養(yǎng)，測(cè)定可溶性磷含量。對(duì)解磷能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行編號(hào)，再經(jīng)富集、馴化后，得到一株解磷能力強(qiáng)的菌株編號(hào)為jl-3。

（4）菌種的鑒定：參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行逐步分析鑒定。觀察記錄菌株的生長(zhǎng)狀況、菌落特征、菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行革蘭氏染色、半固體試驗(yàn)、需氧性試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)等生理生化鑒定，實(shí)驗(yàn)操作方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》完成。16s rDNA測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

（5）可溶性磷含量測(cè)定：采用磷鉬藍(lán)比色法，以相應(yīng)的去離子水為參比液進(jìn)行對(duì)照，利用分光光度計(jì)在660nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株jl-3的鑒定

（1）生理生化鑒定

菌落形態(tài)為圓形，乳黃色，不易挑起。菌體呈桿狀，有鞭毛。菌株jl-3為革蘭氏陰性菌，半固體培養(yǎng)呈陽性，需氧性為兼性厭氧，葡萄糖發(fā)酵呈陽性，乳糖發(fā)酵呈陰性，產(chǎn)氣呈陽性，淀粉水解呈陰性，見表1。

（2）分子生物學(xué)鑒定

16SrDNA序列分析法對(duì)菌株jl-3進(jìn)行鑒定，通過提取DNA、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物測(cè)得到16SrDNA序列信息。利用BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)，檢索同源性高的菌株，并通過建立系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1、圖2。

（3）可溶性磷含量分析

由圖3可知，接種后培養(yǎng)液中有效磷含量快速上升，在第6天時(shí)到達(dá)峰值，隨后開始下降，第8天以

后開始保持穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本研究從九站地區(qū)玉米根際土壤分離得到一株高效解磷菌jl-3，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定該菌株為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。在30℃、pH=7的條件下該菌株具有較強(qiáng)的解磷能力，可為后期進(jìn)行參數(shù)研究、解磷的條件優(yōu)化及復(fù)合菌劑的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

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