高效液相色譜法測定祛風(fēng)止痛片中烏頭堿的含量

曹穩(wěn)根，翟科峰，段 紅，董 增

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000

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高效液相色譜法測定祛風(fēng)止痛片中烏頭堿的含量

曹穩(wěn)根，翟科峰，段 紅，董 增

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000

建立祛風(fēng)止痛片中烏頭堿的高效液相色譜測定方法。色譜柱為Skim-pack vp-ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；流動相為甲醇-0.1%三乙胺(65∶35，v/v)；流速0.8 mL/min；檢測波長235 nm；柱溫35℃。烏頭堿在0.1504～0.3384 μg范圍內(nèi)峰面積與進樣量有良好的線性關(guān)系(r=0.9991)，平均回收率為98.62%，RSD為1.19%。本方法簡便可行，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于祛風(fēng)止痛片制劑的質(zhì)量控制。

祛風(fēng)止痛片；烏頭堿；高效液相色譜法；甲醇-0.1%三乙胺

祛風(fēng)止痛片為國家發(fā)明專利品種，也是國家中藥保護品種，主要由老鸛草、槲寄生、續(xù)斷、威靈仙、獨活、制草烏和紅花七味藥復(fù)方組成，具有祛風(fēng)止痛、舒筋活血、強壯筋骨等功效，臨床用于治療四肢麻木、腰膝疼痛、風(fēng)寒濕痹等癥，是治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的理想藥物，療效確切[1-6]。制劑中制草烏辛、苦、熱，有毒，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的作用，用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛等疾病的治療，其中烏頭堿既是其藥效成分，又是毒性成分，使用不慎極易引起中毒[7-8]。為保證臨床用藥安全有效，控制祛風(fēng)止痛片制劑質(zhì)量，本文建立了祛風(fēng)止痛片中烏頭堿的高效液相色譜測定方法，為祛風(fēng)止痛片制劑的質(zhì)量控制提供一定的依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

LC-20AT島津高效液相色譜儀(日本島津公司)；U-3310紫外分光光度計(日本Hitachi公司)；BP211型電子天平(德國賽多利斯公司)；Millipore simplicity -185型超純水器(美國密里博公司)；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

烏頭堿(批號：720-9807，中國藥品生物制品檢定所)；祛風(fēng)止痛片(批號20080702，20090707，20100103，安徽雪楓藥業(yè)有限公司)；甲醇為色譜純(美國Fisher公司)；其他試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Skim-pack vp-ODS(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%三乙胺溶液(65∶35，v/v)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：235 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對照品溶液

精密稱取烏頭堿對照品0.0047g，用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，配制成188 μg/mL的烏頭堿母液。用時稀釋10倍，即移取1 mL母液用甲醇定容到10 mL容量瓶中，稀釋成濃度為18.8 μg/mL的對照品溶液。

1.3.2 樣品溶液

取同一批號的祛風(fēng)止痛片，去除包衣研成粉末，精密稱取一定量粉末狀樣品置入250 mL具塞三角燒瓶中，加入濃氨水12 mL，放置30 min，加乙醚70 mL，超聲處理30 min，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，再放在50℃水浴鍋中將乙醚揮發(fā)干，最后用甲醇溶解，定容于5 mL容量瓶中，搖勻，即得。

1.4 方法專屬性考察

按“1.2”色譜條件，記錄對照品溶液和樣品溶液色譜圖，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，在該條件下樣品溶液烏頭堿的峰與其對照品溶液的峰保留時間一致，且分離良好，無其他干擾。

1.5 線性關(guān)系考察

分別準(zhǔn)確移取濃度為18.8 μg/mL的對照品溶液 8、10、12、14、16、18 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定其峰面積。以烏頭堿對照品進樣量為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=27950x-60698，r=0.9991。結(jié)果表明，烏頭堿對照品的峰面積與進樣量在0.1504～0.3384 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 對照品烏頭堿(a)和樣品(b)的色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

文獻報道烏頭類生物堿在230～240 nm下有較大的吸收峰，如粟貴[9]等報道檢測波長為230 nm，辛楊[10]等報道檢測波長為235 nm。本實驗對烏頭堿的甲醇溶液進行了紫外吸收光譜掃描。結(jié)果表明，烏頭堿在235 nm 處有最大吸收峰，在此波長下測定時，峰面積大，檢測靈敏度高，故選擇235 nm為檢測波長。

2.2 流動相的選擇

試驗考察了不同比例的甲醇-0.1%三乙胺(60∶40，65∶35，70∶30，75∶25)流動相對峰形和保留時間的影響。結(jié)果表明，甲醇∶0.1%三乙胺流動相為65∶35時，分離最好，峰形好，保留時間為15.75 min；60∶40時，保留時間長，雖然分離好，但峰形較寬；70∶30和75∶25時，保留時間短，峰形尖銳，但分離不好。因此，最終確定甲醇-0.1%三乙胺(65∶35，v/v)為流動相。

2.3 精密度試驗

準(zhǔn)確移取濃度為18.8 μg/mL的對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄烏頭堿峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為0.27%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取批號為20100103的同一樣品溶液10 μL，分別在1、2、4、6、8、24 h后進樣，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為0.67%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗

準(zhǔn)確稱取批號為20100103樣品6份，按“1.3.2”的方法制備樣品溶液。按照“1.2”的色譜條件下進樣，外標(biāo)法計算烏頭堿的含量。結(jié)果烏頭堿含量RSD為0.76%，表明重復(fù)性好。

2.6 加樣回收試驗

準(zhǔn)確稱取批號為20100103樣品6份，分別準(zhǔn)確加入濃度為18.8 μg/mL的對照品溶液1 mL，按“1.3.2”的方法制備樣品溶液，按上述色譜條件測定含量并計算加樣回收率。結(jié)果測得樣品烏頭堿平均回收率為98.62%，RSD為1.19%，結(jié)果見表1。

表1 烏頭堿加樣回收率試驗結(jié)果

2.7 樣品含量測定

表2 祛風(fēng)止痛片中烏頭堿含量測定結(jié)果 n=3

取3批不同批號的祛風(fēng)止痛片樣品，按“1.3.2”項下的方法制備樣品溶液，按同樣的色譜條件下記錄峰面積并計算烏頭堿的含量，結(jié)果見表2。

3 結(jié) 論

本實驗建立的HPLC測定方法簡便可行，準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定性好，在0.1504～0.3384 μg范圍內(nèi)峰面積與進樣量有良好的線性關(guān)系，可用于祛風(fēng)止痛片制劑中烏頭堿的檢測。

[1]張道榮,郭永振,張琦.祛風(fēng)止痛片的制劑藥物及其制備方法、質(zhì)量控制方法:ZL200510097337.X[P].2009-05-13

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010：968

[3]趙向陽.HPLC法測定祛風(fēng)止痛片中蛇床子素和二氫歐芹醇當(dāng)歸酸酯[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析,2016,16(1):112-113

[4]李志浩,瞿京紅,鄭芳,等.RP-HPLC測定祛風(fēng)止痛片中原兒茶酸和原兒茶醛的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2010,12(10):187-189

[5]段紅,翟科峰,曹穩(wěn)根,等.正交試驗法優(yōu)選祛風(fēng)止痛片中續(xù)斷、威靈仙和槲寄生的合提工藝[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010,30(17):1439-1442

[6]段紅,翟科峰,曹穩(wěn)根,等.正交試驗法優(yōu)選祛風(fēng)止痛片中制草烏、獨活的合提工藝[J].中成藥,2010,32(8):1421-1424

[7]李明梅.高效液相色譜法測定麝香風(fēng)濕片中烏頭堿的含量[J].中國生化藥物雜志,2012,33(6):836-838

[8]張宇潔,高蘇亞,韓汾汾.反相高效液相色譜法同時測定烏頭不同部位中新烏頭堿和烏頭堿含量[J].中南藥學(xué),11(7):551-553

[9]粟貴,廖林川,顏有儀,等.HPLC同時測定生物樣品中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的含量[J].中國藥學(xué)雜志,2009,44(12):946-950

[10]辛楊,王淑敏,劉志強.高效液相色譜法測定草烏葉中新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿[J].國外醫(yī)藥：植物藥分冊，2008,23(4):170

(責(zé)任編輯：劉小陽)

2016-08-20

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點項目(KJ2012A264)。

曹穩(wěn)根(1964-),安徽東至人,碩士，教授,主要研究方向：生化藥物分析。

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.11.032

R284.2

A

1673-2006(2016)11-0122-03