植物乳桿菌dy-1發(fā)酵草菇泡菜工藝研究

王強(qiáng)，孫鑫娟，程珂，肖香，董英

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

草菇[Volvariellavolvacea(Bull.exFr.)Sing.]別名南華菇、美味苞腳菇、蘭花菇、麻菇及中國(guó)菇等，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]，是典型的高溫型食用菌。草菇肉質(zhì)肥嫩，味道鮮美，并富含蛋白質(zhì)、氨基酸、VC及磷、鉀、鈣等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)常食用具有降低膽固醇和預(yù)防高血壓、冠心病的作用[2-4]。

我國(guó)草菇的食用方式一直以鮮食為主，但草菇后熟作用強(qiáng)烈，采摘后極易出現(xiàn)褐變、老熟、軟化及自溶液化腐敗等現(xiàn)象[5]。盡管朱東紅等[6]和JIA等[7]學(xué)者對(duì)草菇保鮮進(jìn)行了許多研究，但產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還有一定難度。NOVIANTI 等[8]對(duì)草菇進(jìn)行真空冷凍干燥后雖易于貯藏，便于流通，但由于其能耗多，價(jià)格高，仍難以完全解決草菇供求之間的矛盾。

本研究以草菇為原料，采用植物乳桿菌dy-1(Lactobacillusplantarumdy-1)為發(fā)酵菌株，建立直投式乳酸菌發(fā)酵草菇泡菜工藝，并以自然發(fā)酵作為對(duì)照進(jìn)行對(duì)比分析。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與菌種

草菇：江蘇江南生物科技有限公司提供；食鹽和蔗糖(食用級(jí))：購(gòu)于超市；檸檬酸(食用級(jí))：購(gòu)于江蘇國(guó)信協(xié)聯(lián)能源有限公司；氯化鈣(食用級(jí))：購(gòu)于江蘇科倫多食品配料有限公司。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarumdy-1；菌株編號(hào)：CGMCCNo.601)：由江蘇大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全實(shí)驗(yàn)室自行分離與制備。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

乳酸菌活化與技術(shù)培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基。

NaOH:分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酚酞：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平，上海精科天平儀器廠；電磁爐，九陽(yáng)股份有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀，英國(guó)Stable Micro System有限公司；YTC-2000型打孔器，江蘇省江都市麾村醫(yī)教儀器廠；Color Quest XE型分光測(cè)色儀，美國(guó)Hunter Lab公司；PHS-3TC型酸度計(jì)，上海天達(dá)儀器有限公司；SPX-250B-G型微電腦光照培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；全自動(dòng)滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；無(wú)菌操作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化

將保藏的植物乳桿菌dy-1的菌種按1∶10體積比接種于液體MRS培養(yǎng)基中，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行10 h的第1次活化，將第1次活化菌液按1∶5體積比接種于液體MRS培養(yǎng)基中，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行14 h的第2次活化后備用。

1.4.2 草菇泡菜發(fā)酵工藝流程

1.4.3 草菇泡菜燙漂工藝條件的優(yōu)化

選擇檸檬酸質(zhì)量濃度(1、2、3 g/L)、CaCl2質(zhì)量濃度(6、8、10 g/L)、食鹽質(zhì)量濃度(8、10、12 g/L)、燙漂時(shí)間(5、7、9 min)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，取樣測(cè)定草菇脆度和色差，確定燙漂的最佳工藝參數(shù)。

1.4.4 草菇泡菜發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.4.4.1 食鹽質(zhì)量濃度選擇

分別添加20、30、40、50、60 g/L的食鹽，在植物乳桿菌接種量為5%，蔗糖添加量為20 g/L，置于23 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵5 d，并對(duì)發(fā)酵草菇進(jìn)行總酸含量測(cè)定及感官評(píng)價(jià)，研究食鹽質(zhì)量濃度對(duì)草菇泡菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評(píng)價(jià)的影響。

1.4.4.2 蔗糖質(zhì)量濃度選擇

分別添加0、10、20、30、40 g/L的蔗糖，在植物乳桿菌接種量為5%，食鹽添加量為40 g/L，置于23 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵5 d，并對(duì)發(fā)酵草菇進(jìn)行總酸含量測(cè)定及感官評(píng)價(jià)，研究蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)草菇泡菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評(píng)價(jià)的影響。

1.4.4.3 植物乳桿菌接種量選擇

分別接種2%、3%、4%、5%、6%的植物乳桿菌，在食鹽添加量為40 g/L，蔗糖添加量為20 g/L，置于23 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵5 d，并對(duì)發(fā)酵草菇進(jìn)行總酸含量測(cè)定及感官評(píng)價(jià)，研究植物乳桿菌接種量對(duì)草菇泡菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評(píng)價(jià)的影響。

1.4.4.4 發(fā)酵溫度選擇

按照草菇泡菜發(fā)酵工藝流程，在食鹽質(zhì)量濃度為40 g/L，蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L，植物乳桿菌接種量為5%的條件下，分別在溫度為15、19、23、27、31 ℃的培養(yǎng)箱發(fā)酵5 d，并對(duì)發(fā)酵草菇進(jìn)行總酸含量測(cè)定及感官評(píng)價(jià)，研究發(fā)酵溫度對(duì)草菇泡菜發(fā)酵產(chǎn)酸和感官評(píng)價(jià)的影響。

1.4.4.5 TPA測(cè)定方法

參照文獻(xiàn)[9]的方法制備樣品：草菇經(jīng)打孔器、制取φ1 cm×1 cm的圓柱體；探頭選用：平板圓柱探頭(φ25 mm)；試驗(yàn)參數(shù)設(shè)定：測(cè)試速率、測(cè)后速率均設(shè)定為1.0 mm/s，壓縮量1.5 mm，2次壓縮間隔時(shí)間3 s。

1.4.5 草菇泡菜發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取食鹽質(zhì)量濃度(A)、蔗糖質(zhì)量濃度(B)、植物乳桿菌接種量(C)、發(fā)酵溫度(D)單因素中較優(yōu)的發(fā)酵條件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平表，在此基礎(chǔ)上，以總酸和感官評(píng)分作為評(píng)定指標(biāo)，采取L9(34)正交試驗(yàn)來(lái)確定最優(yōu)的發(fā)酵工藝。采用多指標(biāo)正交試驗(yàn)的變異系數(shù)分析方法對(duì)總酸和感官評(píng)分2個(gè)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算得出綜合評(píng)定值。

1.4.6 優(yōu)化直投發(fā)酵工藝與自然發(fā)酵草菇泡菜品質(zhì)比較

按照上述正交試驗(yàn)得出的草菇泡菜最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，以自然發(fā)酵為對(duì)照，比較其草菇泡菜理化、微生物和感官指標(biāo)差異。

1.4.7 理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)的測(cè)定

pH值的測(cè)定：采用精密pH計(jì)直接測(cè)定。總酸的測(cè)定：參照GB/T 12456—2008采用酸堿中和滴定法測(cè)定。亞硝酸鹽測(cè)定：參照GB 5009.33—2010 采用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定。菌落總數(shù)計(jì)數(shù)：參照GB 4789.2—2010 方法測(cè)定。乳酸菌數(shù)計(jì)數(shù)：參照GB 4789.35—2016 方法測(cè)定。酵母菌和霉菌計(jì)數(shù)：參照GB 4789.15—2010方法測(cè)定。大腸菌群計(jì)數(shù)：參照GB/T 4789.38—2008方法測(cè)定。

1.4.8 感官評(píng)價(jià)方法

將成熟草菇泡菜(含酸量0.5%～0.8%為成熟標(biāo)準(zhǔn))樣品放置在一次性紙盤(pán)中，邀請(qǐng)10名經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)感官評(píng)價(jià)訓(xùn)練的評(píng)審員組成評(píng)定小組對(duì)泡菜的色澤、氣味、滋味、質(zhì)地進(jìn)行感官評(píng)定[10-11]，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 草菇泡菜感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of Volvariella volvacea pickles

1.4.9 數(shù)據(jù)處理

采用Excle 2010統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)制作表格，OriginPro 9.0作圖。應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草菇泡菜燙漂工藝條件的優(yōu)化

如表2所示，影響草菇泡菜燙漂工藝因素的順序?yàn)椋簷幟仕豳|(zhì)量濃度>氯化鈣質(zhì)量濃度>食鹽質(zhì)量濃度>燙漂時(shí)間。對(duì)燙漂工藝過(guò)程的綜合評(píng)定主要是針對(duì)燙漂后草菇的硬度和色差2個(gè)指標(biāo)，參照胡慶國(guó)[12]方法按各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)與各指標(biāo)試驗(yàn)測(cè)試值的隸屬函數(shù)值乘積作為最終綜合評(píng)定值。其中氯化鈣質(zhì)量濃度、食鹽質(zhì)量濃度和燙漂時(shí)間為顯著性因素，檸檬酸質(zhì)量濃度為極顯著性因素。燙漂時(shí)加入氯化鈣和檸檬酸可以改善產(chǎn)品質(zhì)地，提高產(chǎn)品的脆性、彈性和咀嚼性，保持其自然色澤[13-15]，根據(jù)各因素對(duì)燙漂后草菇硬度和色澤的影響結(jié)果，確定草菇燙漂的工藝參數(shù)為：檸檬酸2 g/L，氯化鈣6 g/L，食鹽10 g/L，燙漂時(shí)間9 min。

表2 草菇泡菜燙漂工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The orthogonal experiment result of blanching process

2.2 食鹽質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酸量和感官評(píng)價(jià)的影響

圖1 食鹽質(zhì)量濃度對(duì)草菇發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響Fig.1 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different salty concentration

食鹽添加量會(huì)影響發(fā)酵過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)代謝及泡菜口味，從而影響泡菜風(fēng)味[16]。由圖1和表3可知，隨著食鹽質(zhì)量濃度的增大，總酸含量逐漸降低，主要是由于滲透壓的原因，植物乳桿菌的生長(zhǎng)受到抑制，草菇泡菜發(fā)酵速度減慢，成熟時(shí)間延長(zhǎng)。在20～40 g/L的食鹽質(zhì)量濃度下，發(fā)酵所對(duì)應(yīng)的泡菜總酸差異不顯著(p>0.05)，50 g/L的食鹽已經(jīng)開(kāi)始影響泡菜產(chǎn)酸量，經(jīng)過(guò)顯著性分析，在發(fā)酵5 d時(shí)，其感官評(píng)價(jià)結(jié)果(82.8分)差異顯著(p<0.05)。較低質(zhì)量濃度食鹽條件下草菇泡菜的氣味和滋味較差，可能是由于草菇泡菜酸味較重，咸味不足。而食鹽質(zhì)量濃度過(guò)高，泡菜咸味太重，影響口感。在食鹽添加量為40 g/L時(shí)，草菇泡菜總酸含量為0.78 g/100 g，感官評(píng)分最高為86.2分，因此，選擇食鹽40 g/L為最佳。

表3 不同食鹽質(zhì)量濃度下草菇泡菜感官評(píng)分Table 3 The score of Volvariella volvacea pickles sensory quality at different salty concentration

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差異顯著。

2.3 蔗糖濃度對(duì)產(chǎn)酸量和感官評(píng)價(jià)的影響

圖2 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)草菇發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響Fig.2 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different sucrose concentration

由圖2可見(jiàn)，蔗糖作為植物乳桿菌的碳源，在發(fā)酵的起始階段可有效促進(jìn)植物乳桿菌的生長(zhǎng)，并隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增大，總酸含量增加，成熟時(shí)間縮短。蔗糖添加量在30 g/L和40 g/L時(shí)，在第2天已達(dá)到成熟(總酸含量0.59 g/100g和0.62 g/100g)，在泡菜生產(chǎn)過(guò)程中加入適量蔗糖，可以提高發(fā)酵速度，縮短生產(chǎn)周期。在發(fā)酵后期，隨著發(fā)酵速度減慢，添加蔗糖組泡菜總酸含量差異不顯著(p>0.05)。

由表4可知，當(dāng)蔗糖添加量為40 g/L時(shí)，其感官評(píng)分較低，為78.2分，這是因?yàn)檎崽翘砑恿枯^大時(shí)，泡菜過(guò)甜而掩蓋了其他風(fēng)味物質(zhì)，使其香氣和滋味較差，并且其泡菜水也較粘稠。在蔗糖添加量為20 g/L時(shí)，草菇泡菜感官評(píng)分最高為84.3分，此時(shí)草菇泡菜總酸含量為0.85 g/100 g。因此，結(jié)合草菇泡菜總酸和評(píng)價(jià)指標(biāo)，添加20 g/L的蔗糖為最佳。

表4 不同蔗糖質(zhì)量濃度下草菇泡菜感官評(píng)分Table 4 The score of Volvariella volvacea pickles sensory quality at different sucrose concentration

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差異顯著。

2.4 乳酸菌接種量對(duì)產(chǎn)酸量和感官評(píng)價(jià)的影響

由圖3可知，植物乳桿菌接種量對(duì)泡菜總酸有很大影響，在發(fā)酵前期，產(chǎn)酸量與接種量成正相關(guān)。在發(fā)酵5 d后，接種量為5%的條件下草菇泡菜總酸含量最高為0.90 g/100 g，接種量6%時(shí)草菇泡菜總酸含量則有所降低，主要源于乳酸菌添加量過(guò)多時(shí)，其自身生長(zhǎng)需要消耗大量的糖，卻減少了乳酸的生成[17]。

由表5對(duì)草菇泡菜感官評(píng)分可知，在乳酸菌接種量為5%時(shí)，草菇泡菜評(píng)分最高為80.3分，與乳酸菌接種量在4%時(shí)感官評(píng)分(79.0分)差異不顯著(p>0.05)，乳酸菌接種量太高會(huì)造成泡菜香氣與滋味較差，從而影響泡菜的感官品質(zhì)[18]。因此，選擇4%乳酸菌接種量較為合適。

圖3 植物乳桿菌接種量對(duì)草菇發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響Fig.3 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different inoculation amount of Lactobacillus plantarum

菌接種量/%色澤(20分)氣味(20分)滋味(30分)質(zhì)地(30分)總分214.4±0.71a12.5±0.85a22.9±0.57b24.2±0.63a74.0±0.94a315.6±0.97bc13.2±1.32a23.8±0.63c24.1±0.74a76.7±2.67b415.3±0.95abc14.8±0.92b24.0±0.67c24.9±0.54b79.0±1.83c516.0±1.25c14.9±0.57b24.4±0.52c25.0±0.67b80.3±1.64c615.0±0.82ab14.2±0.92b22.3±0.82a24.4±0.84ab75.9±1.29b

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差異顯著。

2.5 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸量和感官評(píng)價(jià)的影響

由圖4和表6可知，隨著溫度的升高，乳酸菌生長(zhǎng)代謝加快，產(chǎn)酸量較高，在27和31 ℃下發(fā)酵時(shí)，泡菜總酸在2 d時(shí)就接近0.5 g/100 g，達(dá)到成熟。但溫度較高條件下泡菜感官評(píng)分較低，可能是乳酸菌產(chǎn)酸較快，酸味太重，香氣不濃，滋味較差[19]。在15和19 ℃條件下，乳酸菌活性受到抑制，生長(zhǎng)緩慢，不利于總酸的生成。發(fā)酵草菇泡菜的感官評(píng)分隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)， 23 ℃時(shí)感官評(píng)分最高為81.9分，但在23 ℃(總酸含量0.68 g/100 g)與31 ℃(總酸含量0.70 g/100 g)溫度范圍內(nèi)發(fā)酵草菇泡菜的總酸含量差異并不顯著(p>0.05)。綜合草菇泡菜總酸和感官評(píng)價(jià)指標(biāo)，本研究發(fā)酵溫度可選擇23 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)草菇發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響Fig.4 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different temperature

發(fā)酵溫度/℃色澤(20分)氣味(20分)滋味(30分)質(zhì)地(30分)總分1514.4±0.97a13.2±0.79a22.9±0.88a23.2±0.79ab73.7±1.77a1914.9±0.74a13.6±0.84a24.5±0.85b23.8±0.63bc76.8±1.69b2316.5±0.85b15.1±0.88b25.6±0.73c24.7±1.16c81.9±1.45c2714.8±0.92a15.2±1.23b24.3±0.82b23.9±0.99bc78.2±1.62b3114.6±1.07a13.4±0.52a22.4±1.26a22.6±1.17a73.0±1.33a

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差異顯著。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)上述單因素試驗(yàn)初步確定了各因素的最佳濃度，選取食鹽質(zhì)量濃度、蔗糖質(zhì)量濃度、乳酸菌接種量和發(fā)酵溫度作為正交試驗(yàn)的4個(gè)因素，采用L9(34)正交表進(jìn)行優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表7。影響草菇泡菜的因素順序?yàn)椋築>A>D>C，各因素最佳組合為A2B3C1D2。在該組合的工藝條件下，草菇泡菜的總酸為0.83 g/100 g，感官評(píng)分為87分，故確定草菇泡菜的最佳發(fā)酵工藝為：食鹽40 g/L，蔗糖30 g/L，乳酸菌接種量4%，發(fā)酵溫度23 ℃。方差分析結(jié)果表明蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)草菇泡菜的發(fā)酵有極其顯著的影響(p<0.01)，食鹽質(zhì)量濃度和發(fā)酵溫度對(duì)其有顯著影響(p<0.05)。

表7 草菇泡菜發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 The orthogonal experiment results of fermentation Volvariella volvacea

2.7 植物乳桿菌發(fā)酵和自然發(fā)酵泡菜成品品質(zhì)比較

由表8可知，植物乳桿菌直投發(fā)酵草菇泡菜發(fā)酵成熟周期比自然發(fā)酵較短，其亞硝酸鹽含量明顯低于自然發(fā)酵的草菇泡菜(p<0.05)，且遠(yuǎn)低于GB 2762—2017中亞硝酸鹽含量的限量(20 mg/kg)，說(shuō)明植物乳桿菌可以抑制亞硝酸鹽的生成；植物乳桿菌直投發(fā)酵的草菇泡菜成品中霉菌 <10 CFU/g，大腸菌群 <30 CFU/g，符合GB 2714—2015的限量，而自然發(fā)酵草菇泡菜成品中霉菌和大腸菌群均超過(guò)國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)的限量。由于在自然發(fā)酵中容易滋生雜菌，泡菜成熟后氣味和滋味較差，其感官評(píng)分明顯低于植物乳桿菌直投式發(fā)酵。

表8 植物乳桿菌發(fā)酵和自然發(fā)酵泡菜成品理化、微生物和感官指標(biāo)Table 8 Physicochemical and microbial index, sensoryevaluation of Volvariella volvacea pickles with Lactobacillusplantarum and natural fermentation

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差異顯著。

3 結(jié)論

草菇中加入2 g/L的檸檬酸，6 g/L的氯化鈣，10 g/L的食鹽作為護(hù)色劑和保脆劑，時(shí)間為9 min的燙漂預(yù)處理可有效抑制草菇褐變，保持較好的色澤和脆度。在選定的試驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi)，食鹽質(zhì)量濃度，蔗糖質(zhì)量濃度，植物乳桿菌接種量和發(fā)酵溫度均對(duì)草菇泡菜發(fā)酵品質(zhì)有影響，其中以蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵草菇泡菜影響最大，其次為食鹽質(zhì)量濃度和發(fā)酵溫度，乳酸菌接種量影響最小。草菇泡菜發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為：食鹽質(zhì)量濃度40 g/L，蔗糖添加量20 g/L，植物乳桿菌接種量4%，發(fā)酵溫度23 ℃。由植物乳桿菌直投發(fā)酵制備的草菇泡菜中乳酸菌含量高于自然發(fā)酵，其霉菌數(shù)、大腸菌群數(shù)量和亞硝酸鹽含量均遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵，符合相關(guān)國(guó)標(biāo)，食用更加安全，且成熟時(shí)間和感官品質(zhì)均優(yōu)于自然發(fā)酵，泡菜風(fēng)味更加濃郁純正。乳酸菌直投發(fā)酵草菇泡菜不僅能促進(jìn)草菇深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，緩解草菇保鮮期短的壓力，同時(shí)也為食用菌方便食品的開(kāi)發(fā)提供新思路。