橙酒酵母的分離、篩選及鑒定

賈瑞楠，單萬祥，李永仙，鄭飛云，劉春鳳，王金晶，鈕成拓，李崎

(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

甜橙是柑橘的一種，屬于蕓香科柑橘屬植物，在國內具有廣泛的種植區域。甜橙含有多種對人體有益的營養物質，包括維生素、氨基酸、檸檬苦素、礦物質等[1]。目前，甜橙主要以鮮食為主，易致甜橙產量呈季節性過剩，進而造成極大的浪費。市場上甜橙的加工產品種類較少，主要集中于橙汁、果醬等，其附加價值較低，出口渠道較為單一。將橙汁發酵為橙酒能夠保留橙汁中多種營養成分[2]，不僅豐富了甜橙產品市場，并有助增加其產品的附加值，進而有效幫助解決甜橙因季節性過剩造成的浪費問題。

近年來，以水果為原料，經釀造具有獨特水果風味的果酒受到越來越多消費者的青睞，然而橙酒在市場上比較少見，產品多采用葡萄酒酵母發酵或者直接用食用酒精加橙汁經調配勾兌而成，因而產品無典型性、缺乏濃郁香氣、口感欠協調，風味欠優雅。對于果酒釀制而言，菌株發酵性能的優劣直接關系到其代謝產物的種類和含量，因而對產品的口感和風味起著非常關鍵的作用。不同的水果其物質組成和含量也具有很大的差異，因而在發酵時對酵母菌株的性能需求也會不同。篩選出1株適合橙酒發酵的專用果酒酵母顯得尤為重要[3]。據文獻報道，潘訓海[4]、陳瑤[5]以自然環境為分離源從菌種發酵性能方面篩選出適用于橙酒發酵的酵母，得到1株產酒精體積分數達7.5%、殘糖量低于3 g/L、品評結果較好的菌株，取得了初步成果。熊元林[6]、羅佳麗[7]等側重于酵母耐受性的研究，得到1株對酸的耐受能力為pH 2.5、酒精耐受力為10%、氯化鈉耐受力為11%的酵母。目前對于橙酒酵母的研究多為發酵性能和耐受能力，尚處初步階段。缺少發酵風味方向的橙酒酵母篩選工作。

本研究利用橙汁自然發酵，從中分離篩選得到1株酵母菌株，該菌株發酵能力旺盛，果酒口感協調，風味柔和。文中同時對發酵風味進行了分析和探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜橙、蔗糖，市售；偏重亞硫酸鉀(K2S2O5，分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；酵母基因組提取試劑盒，南京優爾博生物科技有限公司；富集培養基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，氨芐1[8]；YPD培養基平板(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，瓊脂粉20。發酵培養基：橙汁，調整糖度為22 °Bx。

1.2 儀器與設備

電子天平(PL2002)、AL204分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；阿貝折光儀，上海豫光儀器有限公司；生化培養箱(BSP-250)、低溫水浴槽，上海博訊公司；氣相色譜串聯質譜聯用儀，美國瓦里安(Varian)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種分離

將成熟的鮮橙榨汁后裝入無菌的三角瓶內，于28 ℃靜置自然發酵。當橙汁發酵液出現大量的氣泡時，取10 mL發酵液加入已滅菌的富集培養基中，于28 ℃培養48 h，取100 μL菌液逐級稀釋后涂布于含有氨芐的抗菌YPD平板上(每個梯度3個平行)，將稀釋的菌液均勻涂布在放置于28 ℃恒溫培養箱培養48 h，觀察菌落生長情況。典型的酵母菌落表面光滑濕潤，呈乳白色，有酒香味[9]。將培養后的平板中具有典型的酵母菌特征的單菌落挑出，進一步在YPD平板中進行二次劃線分離，將得到的單菌落分別經YPD液體培養后于-80 ℃條件下保藏備用。

1.3.2 菌種初篩

吸取100 μL于-80 ℃條件下保藏的菌液入10 mL的YPD培養基中，活化18 h后，將菌液以3%(以橙汁體積計)的接種量接入橙汁發酵培養基中，觀察橙汁進行杜式小管[10]的發酵情況。選擇產氣旺盛并且香氣優良的菌株用以下一步復篩。

1.3.3 菌種復篩

將初篩保留的菌株于YPD培養基中活化18 h后以3%的接種量接入22 °Bx的橙汁中，于25℃恒溫發酵7 d。根據GB/T 15038—2006中的方法測定每株酵母發酵所得橙酒的酒精度[11]，每個樣品均做3次平行試驗，并進行初步的感官評定。

1.3.4 菌種的三級篩選

(1) 酵母pH耐受力實驗

以檸檬酸調節橙汁的pH值為2.5、3.0、3.5、4.0，采用杜氏管發酵，觀察各菌株在不同pH值條件下的杜氏小管產氣情況，每個樣品均做3次平行試驗。

(2) 酵母SO2耐受力實驗

將橙汁中添加不同量的K2S2O5以調節SO2質量濃度為50、100、150、200、250 mg/L，采用杜氏管發酵，觀察各菌株在不同SO2質量濃度下的杜氏小管產氣情況，每個樣品均做3次平行試驗。

(3) 菌株發酵液風味分析[12-13]

將復篩得以保留的菌株進行活化，以3%的接種量接入含糖量22 °Bx的橙汁中，于25 ℃恒溫發酵7 d。利用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)半定量的方法分析檢測橙酒中的風味成分，實驗以2-辛醇作為內標。

發酵液前處理萃取條件為：將3.0 g NaCl加入20 mL干凈無異味的頂空進樣瓶中，加入8 mL發酵后的橙酒，20 μL內標。45 ℃預熱5 min，萃取60 min。萃取結束后，250 ℃解吸附5 min。分析條件與參考文獻[13]相同。

1.3.5 菌株鑒定

從-80 ℃甘油管中取100 μL接種到已滅菌的YPD培養基中，28 ℃、120 r/min培養18 h。取適量培養液離心1 min(12 000 r/min，4 ℃)，棄上清液，獲得適量菌體，用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組。用酵母ITS通用引物擴增18S rDNA，PCR反應條件與參考文獻[13]相同。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并進行DNA測序。并采用MEGA5.0軟件將測序所得的序列與GenBank中酵母菌的18S rDNA序列進行分析，獲得系統發育樹。本研究選取了3種酵母菌：Saccharomycescerevisiae(39、KCCM200270、JCABSC21、CGMCC 2.1423),Candidacylindracea(NRRL Y-17506、JCM 9586),Schizosaccharomycespombe,Schizosaccharomycespombe(KCTC 7522)。

1.3.6 感官品評[14]

組織品評小組(具有相關專業背景的教師6人和碩士研究生14人組成)對橙酒進行感官品評，取平均值。主要從外觀、香氣、風味和典型性4個方面評價。外觀:果酒清亮透明、有光澤無懸浮物和沉淀物，滿分20分；香氣:果香、酒香皆濃馥幽郁，諸香和諧純正，滿分30分；風味:酒體醇厚豐滿或酒體爽口，風味協調，滿分40分；典型性:具有明顯橙酒特征，具有濃郁發酵果酒香味，且酒香純正優雅，滿分10分。

1.3.7 數據分析

PCA可以描述主要成分以及數據的趨勢和可能的分類，是一種有效的數據分析工具。本文使用SPSS 20.0軟件對不同酵母的發酵香氣進行PCA分析，并且對數據進行統計和差異性分析，顯著性界值為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 菌種分離

市售甜橙榨汁后，自然發酵2 d，將發酵液稀釋后在抗菌平板中進行分離純化，如圖1所示，共得到酵母菌株80株。

圖1 橙汁發酵液中富集的酵母Fig.1 Enriched yeast in orange juice fermentation broth

2.2 菌種初篩

采用杜氏小管發酵對分離得到的酵母進行初篩,初篩結果見表1。25 ℃恒溫發酵48 h后，觀察杜氏小管內的產氣情況。結果顯示其中氣體全部充滿小管的有50株并且具有淡淡的酒香，這說明了這些菌株有較強的發酵能力；其中44株酵母的發酵氣味優良，具有明顯的橙香。因此，保留發酵能力旺盛，發酵氣味良好的酵母菌株共44株。

表1 酵母初篩結果Table 1 Results of yeast screening

注：“-”表示氣體不足杜氏小管的1/3體積或發酵液有酸敗的氣味；“+”表示氣體超過杜氏小管的1/3或發酵氣味無酸敗氣味；“++”表示氣體超過杜氏小管的2/3或發酵氣味優良。

2.3 菌種復篩

將初篩得到的44株菌株進行三角瓶發酵，25 ℃恒溫發酵7 d。發酵結束后采用比重瓶法[11]測定其酒精度。各菌株的發酵情況顯示較大的差異性，酒精度最高可達11.75%，最低可達2.52%。乙醇體積分數大于8%的菌株共有16株，經初步的感官品評后，保留酒精度高，同時品評結果良好的酵母菌株9株，繼續進行三級篩選。

2.4 菌種的三級篩選

為了進一步篩選得到性能優良可用于橙酒發酵的菌株，對復篩得到的菌株的耐酸能力，SO2耐受能力，及風味物質進行測定，并以商用葡萄酒酵母D254作為對照。

2.4.1 菌株耐酸能力實驗

橙汁pH值較低，本實驗為評價酵母在低pH值條件下的耐受性,選擇了4個梯度的pH值，結果如表2所示。實驗結果顯示復篩所得的酵母表現出較強的耐酸能力,和商用葡萄酒酵母D254相當,此輪篩選保留所有菌株。

表2 酵母對pH耐受性篩選Table 2 pH tolerance ability of different yeasts

注：“+”表示氣體超過杜氏小管的體積的1/2；“++”表示氣體超過杜氏小管的2/3；“+++”表示氣體充滿杜氏小管，表3同。

2.4.2 菌株耐SO2能力實驗

通常,SO2添加到果汁中可以起到殺菌效果,降低微生物對酵母的不良影響[15]。在葡萄酒的生產中，應用SO2抑制各類雜菌的生長和繁殖。但過量的SO2會影響到酵母的生長,使葡萄酒的發酵周期延長,并使成品具有苦澀感。GB2760—2014中SO2(SO2殘留)的最高使用劑量為0.25 g/L[15]。實驗結果如表3所示,5、8、14、15、20、26號菌株對SO2的耐受性很好，在250 mg/L含量中仍發揮產氣功能,與商用葡萄酒酵母D254相當。

表3 酵母對SO2耐受性篩選Table 3 SO2 tolerance ability of different yeasts

2.4.3 菌株發酵液風味分析

果酒的風味物質對于果酒香氣和酒體的平衡至關重要，也是評價果酒品質的重要指標。醇類、酯類、萜烯類、酸類、酚類化合物是果酒中重要的風味物質，它們賦予了果酒水果、花香等復雜的香氣[16]。將5、8、14、15、20、26、D254菌株進行三角瓶發酵，采用GC-MS半定量的方法檢測橙酒中的風味物質及其含量。表4為不同酵母發酵液的風味物質指標,將不同酵母發酵的各類風味物質指標經SPSS 20.0軟件作PCA分析，如圖2所示，主成分1的貢獻率達到73.5%，20號菌株、D254與主成分1有很高的正相關，5、8、14、15、20、26菌株與主成分1有很高的負相關，可以反映出20號菌株和D254與其他菌株的風味差異顯著。

將有顯著差異的20號菌株與其他菌株比較，如表4所示，20號菌株發酵液各項風味物質含量高于5、8、14、15、26菌株發酵液。同時，相比于葡萄酒酵母D254,20號菌株發酵液的各類物質增幅分別為總醇50.49%，總酯24.85%，萜烯類化合物31.67%，酸類化合物44.71%，酚類化合物59.30%，僅酮醛類化合物略低于D254的發酵液，經SPSS差異顯著性分析后，20號菌株和D254菌株在酮醛類化合物質量濃度上并無顯著差異。同時，7株菌株發酵橙酒的感官評分無顯著差異。保留20號菌株進一步分析。

表4 不同酵母發酵的橙酒的各類風味物質的質量濃度Table 4 Concentrations of various flavors of orange wine fermented by different yeast

注：同一列中不同字母表示顯著差異(p<0.05)。

圖2 不同酵母發酵的橙酒的主成分分析Fig.2 Principal compoment analysis of orange wine fermented by different yeast

為進一步探討各風味組分對于酒體的貢獻，本研究采用OAV值來評價香氣組分對于酒體的貢獻程度。OAV值是指揮發性物質的質量濃度與其閾值的比值[17]。OAV值大于1的物質對于酒體有貢獻。OAV值越大，其對于酒體的貢獻程度越大[18]。橙酒共檢出近50種香氣組分，其中異戊醇、正庚醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸、芳樟醇、β-大馬酮、α-松油醇、月桂烯的香氣活力值大于1，這可能是橙酒風味的的重要香氣組分。酯類物質中辛酸乙酯、癸酸乙酯有濃郁的水果香氣，是果酒中重要的一類香氣物質[19-20]，辛酸、乙酸苯乙酯具有花香香氣。比較20號菌株與葡萄酒酵母D254發酵液中的揮發性物質的OAV值，如表5所示，20號菌株各種香氣組分均大于D254，所列成分中唯β-大馬酮的OAV值略低于D254。經SPSS 20.0軟件作統計學分析，20號菌株與對照菌株D254發酵橙酒的異戊醇、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯的OAV值呈極顯著差異，癸酸乙酯的OAV值呈顯著差異。

表5 橙酒中揮發性成分的OAV值(僅列出OAV>1的香氣成分)Table 5 OAVs of odorants of different orange wines (odorants with OAV above 1.0 were listed)

注：**表示在p<0.01水平上極顯著差異；*表示在p<0.05水平上顯著差異。

綜合以上結果，20號菌株較適合橙酒的釀造，發酵后的橙酒口感清新，香氣馥郁。

2.5 菌種鑒定

20號菌的基因組DNA經提取、PCR擴增及電泳檢測，如圖3所示，結果顯示良好。將擴增產物測序，所得的序列與GenBank中酵母菌的18S rDNA序列用MEGA5.0進行分析，獲得系統發育樹。如圖4所示，20號菌株與釀酒酵母(S.cerevisiae)系統位置最為接近，說明20號菌株屬釀酒酵母屬。同時，測序結果經與NCBI數據庫中BLAST序列比對，發現20號菌與1株釀酒酵母S.cerevisiae(ID：MG101836.1)具有100%的18S rDNA基因序列相似度，由此可確定20號菌株為釀酒酵母。

1-20號菌株；Y-陰性對照；M-Marker圖3 酵母PCR產物瓊脂糖電泳圖Fig.3 PCR products by agarose electrophoresis of yeast

圖4 基于18S rDNA測序構建酵母菌株系統發育樹Fig.4 Phylodenetic tree of S. cerevisiae based on 18S rDNA sequencing

3 結論

選擇果酒發酵的酵母的必要條件包括良好的發酵性能，耐受性強，盡可能的生香能力，發酵產品香氣豐富協調。目前學者對橙酒酵母的篩選多側重于發酵性能和耐受性能。本文在借鑒前人的基礎上，在進行發酵性能和耐受力篩選后，針對發酵風味對酵母進行了進一步篩選，得到1株發酵能力強、發酵后口感柔和、香氣濃郁的橙酒專用酵母，編號為20。

該菌株在含糖量22 °Bx橙汁中，產酒精能力可達11.75%，在pH 2.5，SO2250 mg/L的條件下仍具有良好的發酵能力，與文獻報道中[6]篩選得到的產酒精能力為11.4%，耐受pH 2.5的橙酒酵母相當。在針對發酵風味的菌株篩選中，20號菌株發酵液的醇類、酯類、萜烯類、酸類、酚類化合物的質量濃度均高于商用酵母D254，且與D254在OAV值比較中，除β-大馬酮略低于D254，其余物質OAV值均高于D254。經18S rDNA測序及系統發育樹分析，鑒定其為釀酒酵母(S.cerevisiae)。

橙酒專用酵母菌株的獲得有助于橙汁果酒的改善，為果酒的開發生產奠定了研究基礎。