基于低場核磁共振技術研究凍融過程中松茸品質的變化

石芳，廖霞，李福香，楊雅軒，吳素蕊，明建,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶,400715)2(中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明,650223) 3(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶,400715)

松茸(Tricholomamatsutake)是一種高價值的食藥兼用菌，不僅菌肉肥厚，味道鮮美，還具有抗腫瘤[1-2]、抗氧化[3]、抗輻射[4]、提高免疫力[5]、預防糖尿病、高血壓等疾病的作用[6-7]，素有軟黃金之稱，在日本更被譽為“菌中之王”。松茸是我國出口的重要珍稀食用菌產品之一，其中，云南松茸出口量約占全國出口總量的50%，出口類型主要為鮮松茸和冷藏松茸[8]。松茸含水量高，短時間內就會發生各種生理形態變化，冷凍保藏雖然可以較好地保持松茸原有的品質、風味及營養成分，有效調節季節性、地域性等帶來的問題。但冷凍過程中產生的大小不一的冰晶對松茸組織結構造成破壞，解凍過程也會導致營養成分流失，加之冷鏈體系不完整，特別是由于溫度波動，無可避免在運輸、銷售過程中引起反復凍融，使松茸理化性質改變，降低松茸的食用品質，嚴重影響了松茸的對外貿易，阻礙松茸產業的發展[9]。

低場核磁共振通過弛豫時間T2的變化從微觀角度分析水分子的存在狀態及遷移規律[10-11]，同時利用核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)可以直觀的了解物料內部水分分布情況，觀察物料內部水分廓線特征和變化規律[12]。核磁共振技術因具有測量迅速、準確、無損樣品、多角度獲取信息等[13]優點，越來越受到食品領域學者的重視。目前，NMR技術已成功應用于肉類干燥及反復凍融過程[14-15]、甘薯凍融過程[16]、果蔬貯藏過程[17]、食用菌干燥過程[18-19]等水分分布及遷移規律的研究。但鮮有研究凍融對食用菌品質的影響，且未見從水分分布及流動特性角度解釋其變化的報道。

本文以云南松茸為研究對象，利用LF-NMR技術研究反復凍融處理對松茸水分存在形式的影響，就凍融次數對松茸水分存在形式、色澤、硬度等指標進行相關性分析，探討反復凍融對松茸品質的影響，以期為優化松茸的貯藏方式提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮松茸由云南昆明食用菌研究所提供，產自云南香格里拉，采摘后24 h內運輸至實驗室。挑選無蟲害、大小一致的松茸子實體，清理掉表面灰塵后，用自封袋包裝置于-18 ℃冰柜中凍結12 h，取出置于4 ℃條件下解凍12 h，為1次凍融過程。反復重復上述過程，分別凍融1、2、3、4、5次。

1.2 儀器與設備

核磁共振成像儀(MesoQMR23-060H),上海紐邁電子科技有限公司；電子天平(MS204S),瑞士梅特勒-托利多公司；冰箱(BCD-1607MPQ),青島海爾股份有限公司；色度儀(ultraScan PRO)、質構儀(CT-3)，美國Hunter Lab公司。

1.3 方法

1.3.1 解凍損失率

樣品分別在解凍前和解凍后稱重，并按照公式(1)計算其解凍損失率。

(1)

式中;m1,解凍前樣品的質量，g；m2,解凍后樣品的質量，g。

1.3.2 色澤測定

通過測色儀測定反復凍融后松茸的色澤變化，應用L、a*、b*表示色系，每個樣品重復測定14次，剔除最大值和最小值后，取其余數值的平均值，結果以平均值±標準偏差表示。

1.3.3 質構測定

測定參數為：探頭類型TA44，預測試速度2 mm/s，測試速度1 mm/s，返回速度1 mm/s；循環次數：2次；壓縮比30%；測定指標包括硬度、黏性、彈性、咀嚼性、內聚性。

1.3.4 LF-NMR測定

利用CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)脈沖序列測量樣品的T2橫向弛豫時間，將解凍后的樣品置于磁場中心位置的射頻線圈的中心，利用FID信號調節共振中心頻率，然后進行CPMG脈沖序列掃描試驗。其中共振頻率為21.7MHz，磁體強度0.55T，線圈直徑為60 mm。試驗參數為CPMG：主頻SF(MHZ)=21；偏移頻率O1(kHZ)=76.921；90°脈沖射頻脈寬P1(μs)=11.52；180°脈沖射頻脈寬P2(μs)=22；信號采樣點數TD=252 010；重復采集等待時間TW(ms)=6 000；重復采集次數NS=4；回波時間NECH(ms)=8 000；得到的圖形為自由誘導指數，使用迭代尋優的方法將采集到的T2衰減曲線代入弛豫模型中擬合并反演可以得到樣品的T2弛豫信息。包括弛豫幅值、峰值及每個峰所占的面積分數等。采用弛豫圖中每個組分峰值對應的時間作為T2。

1.3.5 MRI測定

當樣品進行完CPMG序列試驗后，立即進行MSE成像序列實驗，即質子密度成像。樣品置于線圈中央，選取3個層面進行成像。試驗參數為SFO1=21.769；RFA90(%)=5.7；RFA180(%)=7.8；GxOffest=-40；GyOffest=-90；GzOffest=-50；SCOUT RG(db)=20；圖像大小為256×192。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS軟件對實驗數據進行方差分析和相關性分析。相關性分析采用 Pearson法，多重比較采用 Duncan法。

2 結果與分析

2.1 解凍損失率

在不同的加工或貯藏條件下，食用菌水分易流失，食用菌自身結構對水分有一定的束縛力，松茸對水分束縛能力與其色澤，硬度等品質密切相關。圖1為不同凍融次數下松茸的質量變化。由圖1可知，凍融1次后，解凍損失率僅為0.72%，隨著凍融次數的增加，解凍損失率顯著增加，在凍融5次后，解凍損失率高達27.84%。這可能是由于反復凍融使松茸組織結構受到一定程度的破壞，導致汁液流失。

圖1 不同凍融次數對松茸解凍損失率的影響Fig.1 Change in thawing loss of Tricholoma matsutake during freeze-thaw cycles

2.2 反復凍融對色澤的影響

色澤是影響消費者可接受性和產品市場價值的重要品質屬性之一[20]。由表1可知，凍融1次的松茸L值為(37.688±3.857)，隨著凍融次數的增加，L值呈下降趨勢。這可能是因為反復凍融過程中，樣品汁液流失過多，引起樣品表面光鮮反射率下降，從而使樣品亮度減弱[21]。a*值隨著凍融次數增加逐漸減小，凍融5次后，a*值為(12.435±1.647)。凍融1次的松茸b*值為(24.636±4.351)，凍融5次后，顯著下降為(19.590±4.422)。上述結果說明凍融次數對松茸色澤品有一定的影響，且隨著凍融次數的增加其色澤變差。

表1 不同凍融次數對松茸色澤的影響Table 1 Change in color parameters of Tricholomamatsutake during freeze-thaw cycles

注：同一列不同小寫字母代表差異顯著。下同。

2.3 反復凍融對質構品質的影響

表2為反復凍融過程中松茸質構品質的變化，隨著凍融次數增加，松茸硬度、黏性和咀嚼性先顯著下降(p<0.05)，凍融2次的松茸硬度和咀嚼性最低，繼續凍融，硬度和咀嚼性有上升的趨勢，而黏性值變化不大，是由于多次凍融后松茸水分大量流失，組織結構發生塌陷，重疊，導致松茸質地變硬，咀嚼性增強。彈性和內聚性隨著凍融次數的增加略有降低，但沒有顯著變化。因此可以得知，凍融處理松茸可能引起松茸細胞間結合力減弱，組織受到的破壞越來越多。

表2 不同凍融次數對松茸質構的影響Table 2 Change in texture properties of Tricholoma matsutake during freeze-thaw cycles

2.4 凍融次數對橫向弛豫時間的影響

圖2為不同凍融次數下松茸的T2弛豫時間反演波譜圖。與香菇[18]、雙孢菇[22]等食用菌測定結果類似，松茸弛豫圖譜中也含有3個峰，T21(0.01～10 ms)代表與蛋白質等大分子表面極性基團緊密結合的結合水，T22(10～10 ms)代表食用菌細胞內與膠體相結合，不能自由運動的不易流動水。T23(100～1 000 ms)代表存在于細胞毛細管中易流動的自由水。T2值的大小代表水分流動性的強弱，T2值越大表示水分流動性越強，反之，T2值越小表示水分與底物結合越緊密[23]。隨著凍融次數的增加，反演譜曲線積分面積減少，波峰位置不斷前移，說明樣品中的水分含量減小，自由度高的水分向自由度低的水分遷移，樣品中的水與固質的結合程度增大。

圖2 不同凍融次數下松茸自旋-自旋(T2)弛豫時間反演譜Fig.2 Inversion spectrum of transverse relaxation time for Tricholoma matsutake after freeze-thaw cycles注：FD1-FD5代表凍融次數為1-5次。

凍融處理松茸中T21、T22和T23的變化如表3所示。由表3可知，整體而言，隨著凍融次數的增加，3種不同狀態的水分向短弛豫方向遷移，表明水與底物的結合隨著凍融次數的增加而越緊密。T21隨著凍融次數的增加呈現先增加后減小的趨勢，凍融5次后T21減小為5.790 ms，這是因為凍融導致松茸組織結構破壞，不易流動水向結合水遷移，多次凍融后，水分流失嚴重，T21值減小；T22顯著下降，多次凍融后，由最初的55.176 ms降至凍融5次后的31.606 ms，說明不易流動水的流動性減弱，即不易流動水向結合水方向遷移。T23與解凍損失率的變化趨勢一致，凍融2次后，T23由最初的309.099 ms下降為294.308 ms，T23略有下降，但無顯著變化，隨著凍融次數繼續增加顯著下降(p<0.05)，凍融5次后，T23為208.955 ms。這可能是由于低溫導致蛋白質二、三級結構發生改變，與水分子的結合能力隨之變化，以及解凍時汁液流失有關[24]。

表3 凍融次數對松茸自旋-自旋弛豫時間的影響Table 3 Change in transverse relaxation time ofTricholoma matsutake during freeze-thaw cycles

不同組分水的峰積分面積在反復凍融過程中的變化如圖3 所示，A21、A22和A23分別代表結合水、不易流動水和自由水的峰積分面積。A22峰積分面積幅值最大，說明凍融松茸中主要存在的水分組分為不易流動水，其次是結合水，自由水相對較低。隨著凍融次數的增加，A21峰積分面積出現先增加后減小的趨勢，說明結合水含量先增加后減少；A22峰積分面積不斷下降，A23峰積分面積略有增加，但并不顯著。說明反復凍融過程中，主要減少的為不易流動水。因此，松茸不易流動水含量降低可能是松茸解凍損失率增大的主要原因。

圖3 凍融次數對松茸峰積分面積的影響Fig.3 Change in peak area of Tricholoma matsutake during freeze-thaw cycles

T2反演譜中各個峰面積占總峰面積的比例可以表示對應的結合水(P21)，不易流動水(P22)和自由水(P23)的相對含量[25]，凍融過程中不同狀態水分相對含量的變化如表4所示。

表4 凍融次數對松茸對不同狀態水分相對含量的影響 單位：%

凍融1次后，松茸中不易流動水所占比例達91.728%，結合水占比為7.556%，自由水占比為0.715%。說明自由水在凍融1次后，幾乎全部流失。伴隨著凍融次數的增加，結合水的含量出現先增加后減少的趨勢，這可能是因為T21增大，與底物結合較緊密的水自由度增加，因此結合水的含量有所提升，但多次凍融后，隨著汁液的流失，其含量最終降低。不易流動水含量雖然減少，但其所占比例卻表現出交替減少-增加。說明反復凍融過程對不易流動水的影響較大。凍融2次后，不易流動水的含量下降，這可能是由于凍融過程中松茸組織結構受到一定程度的破壞，部分不易流動水向結合水方向移動，凍融5次后，不易流動水的相對含量增加可能是由于凍融使的松茸總體水分含量下降，不易流動水所占的比例上升。自由水含量隨凍融次數的增加而增加，但反復凍融2次至凍融5次之間，自由水相對含量無明顯變化。

2.5 MRI成像

核磁共振成像是一種無損、非侵入性、高效、準確的現代分析技術，可以對食品加工過程的控制及貯藏過程的生理生化反應等進行跟蹤研究[26]。王水晶[27]利用低場核磁共振及其成像技術探究了牛肉糜水分分布情況及遷移規律，研究發現，隨著貯藏時間的延長和反復凍融次數的増加，牛肉中水分的存在狀態發生變化，不易流動水所占比例逐漸降低，自由水比例増加，說明牛肉中的水分發生了遷移。圖4為不同凍融次數下松茸氫質子的質子密度成像圖，代表內部總水分的含量，質子密度越大，信號量越強，水分含量就越高，直觀地表現為圖像顏色越白亮，反之，顏色越暗，則水分含量越低[28]。從質子密度成像圖可知，松茸水分主要分布在子實體中間部分，且較為均勻。隨著凍融次數的增加，圖像中間顏色越來越暗，說明凍融造成水分不斷流失，C為松茸最外層的成像圖，隨著凍融次數的增加，其顏色變化最為明顯，菌柄失水較菌傘嚴重，凍融5次后，菌柄部分區域已無自由水存在。

圖4 不同凍融次數下松茸核磁共振成像圖Fig.4 Nuclear magnetic resonance imagings of Tricholoma matsutake during freeze-thaw cycles注：1-5分別表示凍融1～5次；A-C表示松茸3個不同層面。

2.6 凍融次數與測定指標之間的相關性分析

表5為不同凍融次數的松茸與測定品質指標之間的相關性分析，由表可知，凍融次數與T22、T23、a*、b*和解凍損失率的相關系數分別為-0.973、-0.988、-0.963和0.977，極顯著相關(p<0.01)；說明凍融次數對T2的影響較大，凍融改變了松茸內部不同水分組分的分布情況，可能是因為凍融導致細胞破裂，使松茸內部結構發生了改變，KIDMOSE[28]在冷凍胡蘿卜結構變化的研究中得出類似的結論。凍融次數與L值和b*相關系數分別為-0.920和-0.945，顯著相關(p<0.05)；與硬度、黏性、彈性、咀嚼性、內聚性無顯著相關性。T21與解凍損失率無顯著相關性，T22、T23與解凍損失率極顯著相關(p<0.01)。說明水分的弛豫時間越長，其保水性越差。此外，T23與L值、a*、b*顯著相關，說明自由水的減少是影響色澤品質的重要參數之一。

表5 凍融次數與測定指標之間的相關性分析Table5 Correlation between indexes considered and freeze-thaw cycles

注：n=5，**表示差異極顯著(p<0.01)；*表示差異顯著(p<0.05)。

3 結論

NMR測定結果表明，松茸中存在3種組分水，凍融處理引起T2弛豫時間波峰位置不斷前移，自由度高的水分向自由度低的水分遷移，從而引起各組分水的峰積分面積發生變化，整個變化過程中，A22的峰積分面積一直最大，說明不易流動水的含量始終最高。MRI成像圖中得知，松茸水分主要集中在子實體中間部分，凍融處理引起菌柄失水較菌蓋嚴重。

凍融處理使松茸水分的分布狀態及其組分相對含量的變化是引起品質變化的原因，反復凍融使松茸解凍損失率不斷增加，色澤變差，多次凍融使松茸結構塌陷，重疊，導致硬度先減小后增大。相關性分析結果表明，凍融次數與T22、T23、a*、b*和解凍損失率極顯著相關(p<0.01)。T22、T23與a*、b*和解凍損失率顯著相關(p<0.05)。因此，應用LF-NMR對物料水分狀態及組分含量的測定可以作為預測松茸品質的參考指標。