莢膜紅細菌來源的酪氨酸酚裂解酶的酶學性質

張宇，周景文，堵國成，陳堅,2*

1 (江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2 (江南大學,糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

L-酪氨酸(L-tyrosine,L-Tyr)是一種重要的芳香族氨基酸，常作為營養補充劑[1]、飲料添加劑和配制人工昆蟲飼料等。此外，酪氨酸也是合成多肽類激素、抗生素、L-多巴等藥物的主要原料[2-4]，是合成對香豆酸、柚皮素等高價值化合物的重要前體[5]，被廣泛應用于食品、化工、飼料和醫藥等工業領域。目前，國內外報道的L-酪氨酸制備方法主要有提取法、直接發酵法、有機合成法和酶轉化法[6-8]。提取法由于污染嚴重、生產成本高，已經被逐漸取代。直接發酵法通過代謝工程改造微生物發酵生產L-酪氨酸，由于目前產量和轉化率還較低，未能實現工業應用?；瘜W合成法主要通過L-苯丙氨酸的羥基化或經由對羥苯甲醛與海因縮合、堿解、轉氨、拆分等步驟進行，耗能高、污染嚴重，也已經被逐步淘汰[9-10]。目前，采用酶法合成L-酪氨酸是最為成熟的技術路線[11]。

酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase, TPL，EC 4.1.99.2 )是合成L-酪氨酸、L-多巴的關鍵酶。該酶參與多種催化反應，需要5-磷酸-吡哆醛(pyridoxal-5′-phosphate，PLP)作為輔因子[12]。在生物體內可催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，該反應在一定條件下是可逆的。TPL催化前體銨、丙酮酸和酚類底物轉化合成L-酪氨酸/L-多巴的過程是α和β消除反應的逆過程[13]。酶轉化具有轉化效率高、專一性強、分離純化容易等優點[14]。本文采用丙酮酸路線經TPL一步法催化合成L-酪氨酸[15-16]。為了獲得1株具有高效生產L-酪氨酸性能并且穩定催化性能的TPL菌株，本研究基于pET-28a表達質粒，將源于莢膜紅細菌(Rhodobactercapsulatus)的TPL在大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21(DE3)中進行表達，并對TPL進行純化及酶學性質的分析[17]。研究結果為后期理性改造TPL性能，提高酶法合成L-酪氨酸的效率，并最終實現工業生產提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌宿主菌株JM109、BL21(DE3)、質粒pET-28a(+)為本研究室保藏；來源于R.capsulatus的TPL基因根據大腸桿菌對密碼子的偏好性進行優化，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成后，連接至pET-28a(+)，構建得到表達載體pET28a-ScTPL。

1.1.2 主要試劑

Mix DNA聚合酶，杭州寶賽生物科技有限公司；限制性內切酶、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，Thermo Scientific公司；細菌質粒小量抽提試劑盒、感受態細胞制備試劑盒，上海生工生物有限公司；標準分子量蛋白、蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE預制膠，Life Technologies公司；BCA試劑盒，碧云天。丙三醇、α-乳糖、丙酮酸鈉、乙酸鈉、苯酚、NaCl、NH4Cl、K2HPO4、KH2PO4：分析純，上海國藥集團。

1.1.3 培養基

LB培養基：酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L；固體培養基添加瓊脂條20 g/L，121 ℃滅菌15 min。

TB培養基： 酵母提取物24 g/L、蛋白胨12 g/L、甘油4 mL/L、KH2PO42.3 g/L、K2HPO416.4 g/L；121 ℃滅菌15 min。

Binding Buffer：50 mmol/L KH2PO4，50 mmol/L K2HPO4，調pH至 7.3。

Wash Buffer：50 mmol/L KH2PO4，50 mmol/L K2HPO4，150 mmol/L NaCl，調至pH 7.3。

Elution Buffer：50 mmol/L KH2PO4，50 mmol/L K2HPO4，150 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，用磷酸調pH至7.3。

1.2 實驗方法

1.2.1 載體構建

根據NCBI中R.capsulatus來源的酪氨酸酚裂解酶基因TPL (NCBI登錄號為AF022932.1)的基因序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，經密碼子優化后，連入表達載體pET-28a(+)，構建表達載體，酶切位點為BamH I、Hind III。

1.2.2 TPL誘導表達以及表達條件優化

從LB固體平板上挑取大腸桿菌BL21(DE3)重組菌單菌落轉接于LB液體培養基中(終質量濃度為50 μg/mL的卡那霉素)，37 ℃，220 r/min條件下培養10 h，以1%的接種量轉接至TB培養基，于37 ℃、220 r/min條件下培養2.5 h至菌體OD600達到0.6～0.8時，向培養基中添加終濃度為0.25 mmol/L的IPTG于25 ℃下進行誘導。

基于蛋白表達后，分別對誘導OD600、誘導溫度進行優化，于25 ℃下在OD600分別為0.5、1.0、1.5、2.0、3.5時誘導，在基于最佳誘導OD600下分別于25、30、37 ℃下誘導。由于IPTG濃度會對菌體生長有害，且價格昂貴，而乳糖作為一種二糖，沒有毒性，且價廉易得，因而采用乳糖代替IPTG，優化不同乳糖質量濃度0.1、1、5、10、20 g/L，確定最佳誘導表達條件。

1.2.3 粗酶液的制備以及TPL的分離純化

取發酵液于4 ℃、2 599g離心10 min收集菌體，將收集的菌體用Binding Buffer緩沖液洗滌2次，重懸至菌體濃度OD600為20，冰上放置超聲破碎30 min后，4 ℃、6 654g離心30 min去除細胞碎片，微孔濾膜(0.45 μm)過濾除去雜質，得到粗酶液。

粗酶液利用AKTA蛋白純化系統及5 mL Ni柱(His TrapTMFF，GE)進行蛋白質純化[18]，取純化后的洗脫液在緩沖液(50 mmol/L磷酸鹽緩沖液)中過夜透析，經透析后獲得用于酶催化反應的酶液。柱純化條件：以A液(Wash Buffer)平衡柱子3～5個柱體積后上樣，進樣結束以3～5個柱體積A液繼續平衡柱子，接著以5%的B液(Elution Buffer)洗去雜蛋白，5%～100%線性洗脫10個柱體積，收集洗脫蛋白。對收集的各段洗脫液進行SDS-PAGE分析。最后用超純水沖洗5個柱體積后，再用20%乙醇沖洗3個柱體積，卸下柱子保存。蛋白純化過程中流速均為1 mL/min。

1.2.4 蛋白濃度測定及酶活測定

蛋白濃度的測定:采用碧云天BCA試劑盒檢測方法進行，取適度稀釋的待測樣品加入96孔板，再加入200 μL顯色液，37 ℃靜置30 min后用酶標儀測定562 nm處吸光值，根據標準曲線確定待測樣品的蛋白濃度。

酶活的測定[19]：反應體系為2 mL，反應體系：75 mmol/L丙酮酸鈉，55 mmol/L苯酚，37.5 mmol/L氯化銨，于pH 9.0的銨鹽(150 mmol/L氯化銨、氨水)緩沖液中30 ℃，220 r/min酶催化反應30 min，濃鹽酸終止酶促反應，高效液相色譜檢測反應液中L-酪氨酸的含量。酶活定義為每分鐘內催化生成1 μmol/LL-酪氨酸所需要的酶量為1個酶活單位(U/mL)。

1.2.5 酶學性質分析

用純化后的蛋白測定最適反應pH值、最適反應溫度。于30 ℃條件下進行酶活測定，分別測定TPL于pH 6.0～10.0緩沖液環境中的酶活力，從而測定出TPL的最適反應pH。以測得的最高酶活設為100%，相對酶活計算方法為：其他pH下的酶活/最高酶活[100%；以pH 9.0的PBS作為酶活反應的緩沖液，分別測定于20～60 ℃反應溫度下的酶活，從而測定出TPL的最適反應溫度，以測得的最高酶活設為100%，相對酶活/%=(其他溫度下的酶活/最高酶活×100]。

對純化后的蛋白進行溫度穩定性、pH穩定性、苯酚耐受性的測定。將酶分別在30～60 ℃(間隔5 ℃)條件下孵育0～180 min，每隔20 min取樣檢測，測定殘余酶活；將酶加到pH 6.0～10.0的緩沖液中，40 ℃處理0～120 min，每隔30 min取樣檢測，測定殘余酶活。酶分別在20～100 mmol/L不同底物苯酚濃度下反應，測定殘余酶活。

1.2.6 TPL體外全細胞催化反應

于1.2.2確定的最優條件下進行誘導表達，誘導后于4 ℃、2 599g離心10 min收集菌體用于體外全細胞催化反應，控制菌體濃度為OD600為20。

以丙酮酸鈉、苯酚、氯化銨為底物，進行體外全細胞催化生成酪氨酸的能力進行測定[20]。全細胞轉化反應體系：650 mmol/L氯化銨，50 mmol/L丙酮酸鈉，50 mmol/L苯酚，于37 ℃，220 r/min條件下進行全細胞催化反應30 min，酶活定義為上述條件下每分鐘內催化生成1 μmol/L酪氨酸所需要的細胞量為1個酶活單位(U/g)。

1.2.7 HPLC檢測條件

高效液相色譜儀Agilent 1260，檢測器為紫外檢測器，色譜柱：Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A液為100 mmol/L 醋酸鈉(pH 4.0±0.05)，B液為甲醇，分流比為90∶10；流速為0.6 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL[21]。

1.2.8 LC-MS鑒定條件

色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS柱(2.0 mm×250)；檢測波長：280 nm；柱溫：40 ℃；進樣量10 μL；流速：0.5 mL/min；流動相：0.1%甲酸∶甲醇(9∶1)。

質譜條件 ESI 離子源，正離子模式噴霧電壓4.5 kV，負離子模式噴霧電壓-3.5 kV；一級、二級離子掃描范圍m/z20～2 000；加熱模塊(BH)和曲形脫溶劑管(CDL)溫度均為200 ℃；載氣(氖氣)流速1.5 L/min，離子累計時間10 ms；檢測器電壓1.6 kV；IT真空2.6×10-2Pa，TOF真空2.2×10-4Pa。

2 結果與分析

2.1 表達載體的構建

來源于R.capsulatus的TPL基因經密碼子優化，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，分別以限制性內切酶BamH I、Hind III雙酶切后，與pET-28a(+)連接轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組表達質粒pET28a-RcTPL。提質粒后分別以限制性內切酶BamHI、HindIII雙酶切驗證，核酸電泳得到大小為5 400 bp和1 400 bp左右的條帶，分別與pET-28a和TPL大小一致(圖1)。

M-DL5000 DNA marker; 1-BamH I和Hind III酶切重組質粒pET28a-RcTPL圖1 表達載體酶切驗證瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of expression vectors

2.2 誘導表達優化及純化

2.2.1 TPL誘導表達以及表達條件優化

SDS-PAGE分析TPL在E.coli中的表達情況，如圖2所示，對全細胞分析可見大小約為52 kDa的蛋白條帶與TPL理論值相符，表明TPL基因在E.coli中成功得到表達。

M-標準蛋白Marker; 1-E. coli BL21(DE3)/pET28a;2- E. coli BL21(DE3)/ pET28a-ScTPL蛋白表達;3-pET28a-ScTPL純化酪氨酸苯酚裂解酶圖2 目的基因在E. coli BL21中的表達情況Fig.2 Expression of the tyrosine phenol lyase gene in E. coli BL21

對TPL蛋白誘導OD600、誘導劑濃度、誘導溫度優化后進行分析，結果如圖3。當OD600在1.0時，酶活最高。37 ℃誘導表達時，酶活明顯降低，25 ℃誘導明顯優于30、37 ℃誘導。因此選擇25 ℃為最佳誘導溫度。乳糖誘導質量濃度在1 g/L時酶活最高，不需要較高的乳糖濃度即可達到較好的誘導效果。因此選取最優誘導濃度OD600為1.0，乳糖誘導質量濃度1 g/L，誘導溫度25 ℃。

A-TPL表達誘導時間的優化；B-TPL表達誘導溫度和誘導濃度的優化圖3 誘導OD600、誘導濃度、誘導溫度優化TPL表達Fig.3 Optimization of induced time for TPL expression

2.2.2 TPL的純化

取按照1.2.2處理后的粗酶液利用Ni-NTA親和層析柱進行分離純化。在線性洗脫條件下，TPL在28%～45%緩沖液中被洗脫，在確定了洗脫濃度范圍的基礎上，再進一步以20%、40%、60%、100%洗脫液進行梯度洗脫。在40%洗脫液下可以獲得單一的TPL蛋白，再經50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(K2HPO4、KH2PO4)過夜透析，得到單一的目的蛋白，SDS-PAGE分析可見大小約為52 kDa的蛋白條帶與TPL的理論值相符(圖2)。

2.3 TPL的酶學性質分析

2.3.1 TPL最適溫度、pH的測定

分別對不同pH(6.0～10.0)和溫度(20～60 ℃)條件下酶活性進行檢測分析，結果如圖4所示。pET28a-ScTPL最適反應溫度為40 ℃，最適反應pH為8.5。低于最適溫度40 ℃時，隨著溫度升高，TPL酶活力提高，高于最適溫度時，隨著溫度升高TPL活力下降。ScTPL在pH6.0～8.0，pH9.0～10.0相對酶活都很低，易受酸堿性影響。

圖4 溫度及pH對酪氨酸酚裂解酶活性的影響Fig.4 Effects of temperature and pH on enzyme activity

2.3.2 TPL溫度穩定性、pH穩定性分析

為了獲得最理想的催化性能，減少酶在催化過程酶活性的損失，考察了酶在催化過程中酶活受溫度和pH的影響，對TPL的溫度穩定性和pH穩定性進行了分析。結果如圖5所示。

圖5 溫度及pH穩定性對酪氨酸酚裂解酶活性的影響Fig.5 Effects of thermostability and pH stability on enzyme activity

該酶在低于40 ℃條件下處理120 min仍有大于60%的殘存活力，60 ℃條件下處理20 min剩余小于10%的殘余活力。在50、55 ℃條件下處理100 min殘余活力逐漸降低；該酶在pH 7.0～8.5處理120 min仍有大于40%活力，pH 9.0～10.0處理120 min殘余活力逐漸降低至失活。結果表明ScTPL在低溫、弱堿條件下更穩定。

2.3.3 TPL苯酚耐受性的測定

苯酚是催化合成L-酪氨酸的關鍵底物，對TPL有較大的毒副作用，過高的濃度能抑制TPL的活性，為了分析TPL對苯酚的耐受性，研究了在不同苯酚濃度下酶活損失情況(結果如圖6)。隨著底物苯酚濃度的增加，殘余活力逐漸降低，ScTPL耐苯酚的性能逐漸降低，在苯酚濃度為80 mmol/L時，酶活損失最大。結果表明在較低底物苯酚濃度下酶的催化性能更穩定，這為后期進行分子改造提高苯酚耐受性以及通過補料降低底物抑制提供參考意義。

圖6 苯酚濃度對酪氨酸酚裂解酶活性的影響Fig.6 Effects of phenol concentration on enzyme activity

2.4 TPL酶活、體外催化特性的測定分析

按照1.2.4方法測定TPL酶活，最終測得ScTPL酶活為0.29 U/mL，比酶活分別為0.29 U/mg。檢測ScTPL全細胞催化的酶活為0.41 U/g，反應10 h產量為0.30 g/L。對TPL催化合成L-酪氨酸進行LC-MS驗證，結果如圖7所示，一級、二級質譜掃描的m/z與L-酪氨酸標品相對分子質量一致，所檢測產物為L-酪氨酸。

圖7 TPL催化合成L-酪氨酸的LCMS驗證Fig.7 Analysis of L-tyrosine production with TPL by LCMS

3 結論

利用酶法合成氨基酸是近年來氨基酸工業的研究熱點之一。國外主要研究L-酪氨酸通過TPL水解生成銨、丙酮酸和酚類物質的α和β消除反應過程[22-23]。TPL能催化多個重要反應，但對其正向催化生產酪氨酸性能性質的研究報道較少。國內主要通過對來源于弗氏檸檬酸桿菌的酪氨酸酚裂解酶基因構建重組表達載體合成L-酪氨酸[24]，其他來源的酪氨酸酚裂解酶基因的研究鮮有報道。為了提高L-酪氨酸的產量，本研究選取R.capsulatus來源的酪氨酸酚裂解酶，基于pET-28a表達質粒成功異源表達于大腸桿菌中，通過His TrapTMFF柱純化得到了純度較高的TPL，測得TPL的酶活為0.29 U/mL，比酶活分別為0.29 U/mg，最適反應溫度為40 ℃，最適反應pH為8.5左右，且經過HPLC驗證可催化得到L-酪氨酸。之前研究中弗氏檸檬酸桿菌來源的TPL(CfTPL)水解催化反應的最適溫度為45 ℃，最適pH為8.5。這兩個TPL有著相近的最適反應溫度、pH以及pH穩定性[25]。研究結果表明，本文中的ScTPL于45 ℃下處理60 min后殘存酶活仍大于60%，而CfTPL殘存酶活小于20%。因此，ScTPL溫度穩定性顯著優于CfTPL，在實際應用中具有一定的優勢。此外，本文在對ScTPL正向催化合成酪氨酸反應性質的研究基礎上，對ScTPL的活性和穩定性方面進行了研究，為后續采用定向進化或理性改造提高TPL的溫度穩定性和底物耐受性提供了重要參考。