一枝黃花的提取工藝研究

毛艷峰 康興東 劉九平 楊偉慶 梁 佳

（江西普正制藥有限公司，江西吉安331409）

0 引言

一枝黃花是菊科一枝黃花屬植物一枝黃花（Solidago decurrens Lour.）的干燥全草，主產(chǎn)于長(zhǎng)江以南各地[1]。一枝黃花的化學(xué)成分包括黃酮、皂苷、苯甲酸芐酯、當(dāng)歸酸桂皮酯、炔屬化合物、苯丙酸等[2]。在2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部中，一枝黃花是以蘆丁作為其指標(biāo)性成分進(jìn)行定量考察的[3]。本文采用正交試驗(yàn)法，結(jié)合單因素考察，以有效成分蘆丁作為指標(biāo)，對(duì)一枝黃花的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，為一枝黃花生產(chǎn)工藝的確定提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材

一枝黃花藥材購(gòu)自貴州遵義，經(jīng)江西普正制藥有限公司質(zhì)量管理部檢測(cè)為一枝黃花。

1.2 儀器

高效液相色譜儀：Waters1525型高效液相色譜儀；色譜柱：Hypersil C18柱（4.6 mm×250 mm）；JK-100型超聲波清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）；SHB-ⅢS型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；RE-5203A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HHS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海東星建材實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）。

1.3 試劑

乙腈、甲醇為色譜純，超純水，其余試劑為分析純。

2 提取方法

選擇乙醇回流提取法和水煎煮法對(duì)一枝黃花藥材進(jìn)行提取，結(jié)合HPLC法測(cè)定蘆丁含量，對(duì)其提取工藝進(jìn)行初步研究。

2.1 乙醇回流提取法

2.1.1 60%乙醇回流提取

稱取一枝黃花藥材10 g，用60%乙醇（V/V）回流提取2次，每次加入60%乙醇10倍量，第一次提取3 h，第二次提取2 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100mL，再取2mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

2.1.2 70%乙醇回流提取

稱取一枝黃花藥材10 g，用70%乙醇（V/V）回流提取2次，每次加入70%乙醇10倍量，第一次提取3 h，第二次提取2 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100mL，再取2mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

2.1.3 80%乙醇回流提取

稱取一枝黃花藥材10 g，用80%乙醇（V/V）回流提取2次，每次加入80%乙醇10倍量，第一次提取3 h，第二次提取2 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100mL，再取2mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

2.2 水煎煮法

稱取一枝黃花藥材10 g，用水煎煮2次，每次加水10倍量，第一次煎煮3 h，第二次煎煮2 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

2.3 合格標(biāo)準(zhǔn)

2.3.1 檢測(cè)方法

按照《藥典》四部通則0512規(guī)定的高效液相色譜法測(cè)定一枝黃花中的蘆丁含量。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-甲醇-0.4%醋酸溶液（16∶8∶76）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

對(duì)照品溶液的制備：取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流40 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.3.2 合格標(biāo)準(zhǔn)

本品按干燥品計(jì)算，含無(wú)水蘆丁（C27H30O16）不得少于0.10%，即1 mg/g。

2.4 結(jié)果

采用上述提取方法所得一枝黃花提取液中的蘆丁含量如表1所示。

從表1可知：采用乙醇回流提取法和水煎煮法所提取的無(wú)水蘆丁含量相差較多。水煎煮法的無(wú)水蘆丁得率約為乙醇回流提取法的1/10～1/8。而采用60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇回流提取的無(wú)水蘆丁含量差別不大。

3 提取正交試驗(yàn)

通過(guò)上述對(duì)不同提取方法的考察，本文選擇了乙醇回流提取法對(duì)一枝黃花進(jìn)行提取，并繼續(xù)通過(guò)采用正交試驗(yàn)法對(duì)乙醇回流提取法的工藝參數(shù)進(jìn)行考察。

3.1 因素水平的確定

正交試驗(yàn)以蘆丁得率為指標(biāo)，對(duì)乙醇濃度（因素A）、乙醇用量（因素B）、提取時(shí)間（因素C）、提取次數(shù)（因素D）四個(gè)參數(shù)進(jìn)行考察，因素水平表如表2所示。

按照L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行9組試驗(yàn)。由于沒(méi)有空白因素列，因此每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，共進(jìn)行27次試驗(yàn)，根據(jù)每次試驗(yàn)的誤差與整體試驗(yàn)的誤差，檢驗(yàn)該正交試驗(yàn)的可行性。

表1 提取液中蘆丁含量

表2 因素水平表

3.2 正交試驗(yàn)方法

3.2.1 試驗(yàn)一

稱取一枝黃花藥材10 g，用50%乙醇（V/V）回流提取1次，加入50%乙醇6倍量，提取1 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

3.2.2 試驗(yàn)二

稱取一枝黃花藥材10 g，用50%乙醇（V/V）回流提取2次，加入50%乙醇8倍量，每次提取1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

3.2.3 試驗(yàn)三

稱取一枝黃花藥材10 g，用50%乙醇（V/V）回流提取3次，加入50%乙醇10倍量，每次提取2 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

3.2.4 試驗(yàn)四

稱取一枝黃花藥材10 g，用70%乙醇（V/V）回流提取3次，加入70%乙醇6倍量，每次提取1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

3.2.5 試驗(yàn)五

稱取一枝黃花藥材10 g，用70%乙醇（V/V）回流提取1次，加入70%乙醇8倍量，提取2 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

3.2.6 試驗(yàn)六

稱取一枝黃花藥材10 g，用70%乙醇（V/V）回流提取2次，加入70%乙醇10倍量，每次提取1 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

3.2.7 試驗(yàn)七

稱取一枝黃花藥材10 g，用90%乙醇（V/V）回流提取2次，加入70%乙醇6倍量，每次提取2 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

3.2.8 試驗(yàn)八

稱取一枝黃花藥材10 g，用90%乙醇（V/V）回流提取3次，加入70%乙醇8倍量，每次提取1 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

3.2.9 試驗(yàn)九

稱取一枝黃花藥材10 g，用90%乙醇（V/V）回流提取1次，加入70%乙醇10倍量，提取1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

按照L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)因素水平試驗(yàn)3次，結(jié)果如表3所示，方差分析如表4所示。

3.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

（1）提取一枝黃花時(shí)，A、B、C、D四個(gè)因素均具有極顯著性差異，這些影響因素按序排列為D＞A＞C＞B，即提取次數(shù)＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞乙醇用量。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析

（2）直觀分析正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，提取效率最高的工藝參數(shù)組合為A2B1C2D3，即70%乙醇6倍量、每次提取1.5 h、提取3次，蘆丁平均提取效率為12.72 mg/g。

（3）經(jīng)方差分析可知，最佳提取工藝參數(shù)為A2B3C2D3，即70%乙醇10倍量、每次提取1.5 h、提取3次，具體相關(guān)提取效率需經(jīng)過(guò)中試驗(yàn)證確認(rèn)。

4 正交試驗(yàn)的工藝驗(yàn)證

4.1 中試工藝驗(yàn)證

綜合正交試驗(yàn)結(jié)果分析和實(shí)際提取成本兩方面進(jìn)行考慮，對(duì)最佳提取工藝和提取效率最高的工藝進(jìn)行中試提取驗(yàn)證，提取條件為：稱取一枝黃花藥材100 g，用70%乙醇（V/V）10倍量回流提取3次，每次提取1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后加水定容至1 000 mL，再取20 mL用70%乙醇定容至100 mL，即得供試品溶液，取樣進(jìn)行蘆丁含量檢查。連續(xù)進(jìn)行3次中試工藝驗(yàn)證，以檢查其工藝的重現(xiàn)性。

4.2 檢驗(yàn)方法

按照《藥典》四部通則0512規(guī)定的高效液相色譜法測(cè)定一枝黃花中的蘆丁含量。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-甲醇-0.4%醋酸溶液（16∶8∶76）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

對(duì)照品溶液的制備：取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流40 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

4.3 合格標(biāo)準(zhǔn)

本品按干燥品計(jì)算，含無(wú)水蘆丁（C27H30O16）不得少于0.10%，即1 mg/g。

4.4 驗(yàn)證結(jié)果

正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果如表5所示。

表5 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

驗(yàn)證結(jié)果顯示：按最佳提取工藝參數(shù)，即70%乙醇10倍量回流提取3次，每次提取1.5 h，經(jīng)連續(xù)3次試驗(yàn)驗(yàn)證，無(wú)水蘆丁（C27H30O16）含量均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

5 結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)采用HPLC法測(cè)定蘆丁含量后發(fā)現(xiàn)，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，乙醇回流提取法和水煎煮法提取一枝黃花中的蘆丁含量相差較多。水煎煮法的蘆丁得率約為乙醇回流提取法的1/10～1/8；而采用60%～80%濃度乙醇提取一枝黃花所得的蘆丁含量相差不多，因此選擇乙醇回流法提取一枝黃花。

在一枝黃花的正交試驗(yàn)提取考察中，乙醇濃度、乙醇用量、提取次數(shù)、提取時(shí)間四個(gè)因素均具有極顯著性差異，這些影響因素按序排列為提取次數(shù)＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞乙醇用量。

按最佳提取工藝參數(shù)，即70%乙醇10倍量、每次提取1.5 h、提取3次，經(jīng)中試工藝驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，無(wú)水蘆丁含量均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，表明該提取工藝的重現(xiàn)性好，為一枝黃花提取工藝的確定提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。