小麥根際解磷細菌的篩選鑒定及其促生效果

常慧萍，夏鐵騎，付瑞敏，楊 雪，邢文會，韓鴻鵬，張 紅

(1.河南教育學院生命科學系，河南鄭州 450046； 2.濮陽職業技術學院，河南濮陽 457000)

氮、磷、鉀是植物生長發育過程中必需的3種礦質元素，被稱作“肥料三要素”。提高土壤磷素和磷肥的利用效率、開發磷肥資源潛能是節約磷肥的重要措施，對我國農業可持續發展具有重要意義。土壤中含量豐富的磷元素95%以上與土壤中的Fe3+、Ca2+、Al3+等結合，以難溶性的磷酸鈣鹽形式存在而喪失其有效性，導致我國2/3的耕地缺磷[1-2]。為解決土壤缺磷問題，提高作物產量，每年須向土壤中施入大量可溶性化學磷肥，但長期過量使用帶來了環境污染、土壤板結、地力衰退、生態惡化和農產品品質下降等問題[3]。生產實踐證明，微生物肥料在提升耕地土壤肥力、維持耕地土壤結構、保持耕地土壤健康、降低耕地土壤污染、提高耕地農產品品質上效果顯著，在國家耕地質量提升的需求中具有廣闊的應用前景[4]。

解磷微生物是能將土壤中難溶性化合態磷轉化為植物能夠吸收利用的可溶性磷的特殊微生物功能類群，在轉化土壤難溶性磷、提高土壤中有效磷含量、磷肥利用率及促進作物生長等方面具有顯著作用[5-6]。某些植物根際促生細菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)可分泌有機酸溶解難溶性無機磷酸鹽，或分泌胞外磷酸酶將難溶性的磷酸脂等有機磷消解，釋放出生物有效磷，提高土壤中可溶性磷的含量，促進植物生長[1]。史發超等篩選了1株可溶解難溶性磷的菌株P83斜臥青霉菌(Penicilliumdecumbens)，能顯著增加土壤有效磷水平，對玉米生長和增產具有顯著作用[6]；姜瑛等分離了1株貪噬菌屬(Variovoraxsp.)的固氮解磷菌JX14，顯著促進了花生的生長及其全氮、全磷、全鉀含量的提高[8]；張云霞等分離了1株高效解磷的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)JT-1，提高了磷肥利用率10.79%，促進小麥增產12.3%[9]。根際微生物研究的最終目標是充分利用根際微生物資源，促進植物生長、保持植物健康、減少農用化學品的投入，從而促進農業可持續發展[10]。本研究根據PGPR的促生長指標如產生植物生長素、產生HCN、產生鐵載體、溶磷、拮抗病原菌篩選小麥根際優良的解磷菌，通過小麥的Hoagland半固體培養基栽培試驗，評估解磷菌劑對小麥生長的影響，以期為小麥高效解磷微生物肥料研究與開發提供優良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥種子為新麥26，土壤樣品采自鄭東新區小麥田，深度為0～20 cm根系及土壤，保存于無菌紙袋中。

1.2 培養基、試劑

所用培養基、試劑包括LB培養基與PDA培養基[11]、蒙金娜有機磷培養基與PKO無機磷培養基[12]、MM培養基[13]、NB培養基(牛肉浸膏3 g、酵母粉1 g、蛋白胨5 g、蔗糖10 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L，pH值7.2)、CAS檢測培養基[14-15]、Hoagland半固體培養基和磷酸鹽(PBS)緩沖液[16]、蛋白胨水(蛋白胨10 g、氯化鈉 5 g、蒸餾水1 L，pH值7.8)。

1.3 方法

1.3.1 土壤樣品稀釋液的制備 將小麥根系剪為約3 cm的根段并混合，稱取10 g置于含有無菌水的三角瓶中充分振蕩，得到小麥根際土壤懸液，將懸液稀釋為10-1～10-6梯度稀釋液。

1.3.2 小麥根際解磷菌的初篩 分別取10-3～10-6稀釋液均勻涂布到PKO無機磷培養基和蒙金娜有機磷培養基上，初篩具有解磷能力的菌株。28 ℃培養3～5 d，挑取溶磷圈直徑/菌落直徑(D/d)較大的單菌落，多次繼代培養，選取長勢旺盛的菌株。

1.3.3 小麥根際解磷菌的復篩

1.3.3.1 產生長素(IAA)的測定[17]稱取分析純吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，用蒸餾水配制濃度分別為10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L的IAA溶液，在530 nm下測定各溶液的D530 nm，繪制IAA的標準曲線。

將初篩解磷菌接種于MM液體培養基中，25 ℃、180 r/min 振蕩培養12 d，離心得上清液。取1 mL上清液加入2 mL Salkowski’s反應液(1 L 10.8 mol/L H2SO4中含4.5 g的FeCl3)，暗處25 ℃混合反應30 min。測定混合反應液D530 nm，空白培養基作為對照。根據IAA的標準曲線計算初篩菌株IAA產生量(mg/L)。

1.3.3.2 產鐵載體檢測[14，16]將初篩解磷菌于LB培養基上培養至對數期，按三點接種法點接在CAS固體檢測平板上，28 ℃培養2 d。根據菌落周圍是否出現明顯的橙色暈圈，判斷菌株產鐵載體的能力。

1.3.3.3 產HCN能力測定 滅菌后NB培養基中添加甘氨酸(濃度為4.4 g/L)，劃線接種初篩菌株，并把浸過2%碳酸鈉、0.5% 2，4，6-三硝基苯酚溶液的濾紙平鋪于平板上，28 ℃ 培養4 d，根據濾紙顏色變化(橘黃色轉變為紅色)判斷菌株產HCN的能力。

1.3.3.4 解磷性能的測定[15，18]將初篩解磷菌接種到液體PKO培養基(或蒙金娜培養基)上，28 ℃、160 r/min振蕩培養 4～5 d，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，鉬銻抗比色法測定有效磷含量。

1.3.3.5 產NH3能力測定 將初篩解磷菌接種到含蛋白胨水的試管中，28 ℃培養2～3 d，加入0.5 mL Nessler’s試劑，根據蛋白胨水顏色變化(由褐色變為黃色)判斷菌株產生NH3的能力。

1.3.3.6 與病原真菌拮抗作用的測定[19]初篩菌株與病原菌拮抗作用的測定采用平板對峙法。PDA平板接種小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、水稻紋枯病菌(R.solani)，25 ℃培養5～7 d獲得病原菌菌餅，LB液體培養基中培養初篩解磷菌48 h獲得菌懸液。將病原菌與初篩菌株同時接種PDA平板：平板中心接種病原菌菌餅(直徑為5～6 mm)，距中心約3 cm處滴加初篩菌株懸液。25 ℃培養3～5 d，記錄病原菌的菌落半徑(R)、病原菌點樣中心點到被初篩菌株抑制的邊緣的半徑(r)，計算抑制率：抑制率=(R-r)/R×100%。

1.3.4 解磷菌株的鑒定 依據《常見細菌系統鑒定手冊》對解磷菌HP1218的形態特征及生理生化特性進行研究。提取HP1218的總DNA，分析其16S rDNA基因序列。PCR擴增上游引物8f序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′，下游引物1541r序列為5′-AAGGAGGTGATCCANCC RCA-3′，PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 終止反應。純化獲得的PCR產物由微基生物科技(上海)有限公司進行測序。將16 S rDNA基因序列通過BLAST程序與GenBank中核酸數據進行比對分析，使用MEGA 6.0軟件對菌株進行系統發育分析，采用鄰接法(Neighbour-Joining，簡稱NJ法)構建系統進化樹。

1.3.5 解磷菌株對小麥幼苗生長的影響[20]選取飽滿、健壯的小麥種子進行表面消毒，并于25 ℃暗處萌發2 d。設置2個處理：接菌處理(HP1218)，將解磷菌HP1218的培養液用PBS緩沖液洗滌并稀釋至1×108CFU/mL左右，萌發種子浸入稀釋菌液中吸附1 h；對照處理(CK)，萌發種子浸泡在PBS緩沖液中1 h。將2種不同處理的小麥種子分別播種于Hoagland半固體培養基中，人工智能培養箱中(25 ℃，14 h光照/10 h黑暗，40%～50%相對濕度)培養10 d，培養后10 d統計種子萌發的根數，并測定幼苗的根長與株高。

2 結果與分析

2.1 解磷菌株的初篩

在PKO無機磷培養基、蒙金娜有機磷培養基上分別涂布小麥根際土壤稀釋液，28 ℃培養3～5 d后，挑取有溶磷圈的解無機磷細菌12株，解有機磷細菌12株，經多次繼代，最終選取長勢較好、D/d較大的解無機磷細菌4株，解有機磷細菌4株。

2.2 解磷菌株的復篩

對初篩的4株解無機磷細菌、4株解有機磷細菌進行生長性能的測定，結果見表1。根據菌株產IAA能力、溶磷能力，且具有產HCN、NH3或者產鐵載體的能力，篩選出HP1218、HP1220、HP1223、HP1224菌株，與病原菌的進行拮抗試驗。

表1 菌株的促生長性能

將HP1218、HP1220、HP1223、HP1224菌株分別與小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌進行拮抗試驗，結果見表2。從表2可知，對3種病原菌均有抑制能力的菌株為HP1218、HP1223。綜合兩者的促生長特性，篩選HP1218作為解磷菌肥料的功能菌株。

表2 菌株對病原真菌的抑菌率

2.3 解磷菌株的鑒定

由表3可知，菌株HP1218呈短桿狀、革蘭氏陰性菌，不產芽孢，具有運動性；菌落淡黃色、圓形、濕潤光滑、邊緣整齊；能發酵葡萄糖，水解淀粉，不液化明膠，吲哚試驗、甲基紅試驗、V-P反應陰性，能夠利用檸檬酸鹽和甘露醇，接觸酶、過氧化氫酶陽性。

表3 解磷菌HP1218的形態特征及生理生化特性

對菌株HP1218的16S rDNA基因序列進行比對分析，構建系統進化樹，由圖1可知，HP1218與假單胞菌屬成員具有較高的序列相似性，與假單胞菌屬(Pseudomonassp.)菌株H9zhy(AM410625.1)親緣關系最近，且BLAST比對結果顯示2株菌的16S rDNA基因序列相似度達到99%以上。結合HP1218形態特征、生理生化特性，依據《常見細菌系統鑒定手冊》，確定HP1218屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)細菌。

2.4 解磷菌對小麥幼苗的促生效果

用PBS緩沖液稀釋HP1218的菌液，小麥種子通過浸種方式接種。從圖2可以看出，HP1218浸種處理萌發5條根的小麥種子所占比例為35.5%，顯著高于對照(31.6%)；萌發6條根的小麥種子所占比例為13.5%，顯著高于對照(9.4%)；萌發3條根和4條根的比例總和由對照59.0%下降為51.0%。由圖3可知，HP1218浸種處理的小麥幼苗平均根長為12.4 cm，較對照增加20.4%；小麥幼苗平均株高為 15.4 cm，較對照增加13.2%。表明菌株HP1218對小麥種子的生根和幼苗生長均有明顯的促進作用。

3 討論與結論

我國74%的耕地缺磷，且土壤中95%以上的磷素呈無效態，作物對施入的磷肥當季利用率僅為5%～25%。由于大部分磷素與土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等結合形成難溶性磷酸鹽，導致土壤磷素快速積累，有效磷缺乏。具有解磷能力的植物根際促生細菌，能夠礦化難溶性磷酸鹽，為植物可吸收利用的可溶性磷，這些PGPR菌株可作為生產微生物肥料的潛在菌株。目前報道的解磷細菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌菌屬、固氮菌屬(Azotobacter)等；解磷真菌主要是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和根霉屬(Rhizopus)；解磷放線菌多為鏈霉菌屬(Streptomyces)。史國英等從甘蔗根際土壤中篩選到1株具有較強解無機磷能力的洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)BS06，研究表明BS06能顯著促進甘蔗組培苗的生長并提高甘蔗植株的含磷量[21]。Babana等研究了大田條件下解磷微生物對小麥的促生效果，出苗5 d后小麥的根干質量增加128%[22]。陳丹陽等篩選到1株鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)的解磷菌，利用薄層層析法分析其產生的有機酸，并研究其解磷機理[23]。Hariprasad等對16株解磷菌在溫室條件下進行了番茄接種試驗，發現處理植株的根長、株高、鮮質量、干質量和番茄的磷含量均有不同程度的提高[24]；邢芳芳等篩選了1株具有溶磷作用的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)PSM，盆栽試驗表明，PSM解磷菌顯著提高白菜的葉綠素、生物產量和葉片數，對白菜的促生作用明顯[25]。本研究根據菌株產IAA、NH3、HCN、鐵載體的能力、溶磷能力以及拮抗病原菌的作用，從小麥根際篩選出解磷菌HP1218，具有產NH3和鐵載體的能力，發酵液中IAA含量可達到 54.21 mg/mL，有效磷含量為35.39 mg/L，且對小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌3種病原菌均有拮抗能力。經鑒定，解磷菌HP1218屬于假單胞菌屬細菌。菌株HP1218浸種接種的小麥幼苗萌發5、6條根的比例分別比空白對照增加31.6%、9.4%；平均根長較空白對照增加20.4%，平均株高較空白對照增加13.2%。結果表明，解磷菌HP1218對小麥種子的生根和幼苗生長均有明顯的促進作用，可作為解磷微生物肥料開發的功能菌株。