外源砷脅迫對土壤細菌群落結構的影響

史曉凱，馬茹茹，顏道浩，劉利軍，劉永杰

(1.山西省土壤環境與養分資源重點實驗室，山西太原 030027； 2.山西省環境科學研究院，山西太原 030027；3.山西晉環科源環境資源科技有限公司，山西太原 030024)

砷是廣泛存在于自然界的一種類金屬元素，是五大劇毒元素之一。土壤砷污染已經成為世界范圍內嚴重的環境問題，受到了國內外的普遍關注和重視[1]。我國土壤中砷平均濃度為11.2 mg/kg，約為世界平均值(6 mg/kg)的2倍[2]。2014年全國土壤污染狀況調查公報顯示，我國土壤中As含量點位超標率為2.7%，是僅次于Cd的第二大污染物。山西省為全國砷污染最為嚴重的地區，主要分布于桑干河、黃水河及兩河間的大同盆地及磁窯河和文裕河之間的晉中盆地，區域內地下水中砷含量最高達1 932 μg/L，是典型的地方性砷病區。

土壤微生物是土壤生態系統中最活躍的部分，土壤結構的形成、土壤中物質的降解循環和能量轉化等重要過程都有微生物的參與。此外，土壤微生物在維持土壤功能方面也有很大貢獻，土壤生態系統的正常運轉、凈化、緩沖污染物等功能都離不開土壤微生物的作用。土壤微生物對土壤質量變化響應靈敏，是土壤環境質量評價的重要指標[3-12]。不同砷污染土壤環境中微生物的種類和特征各不相同。針對砷污染對土壤微生物菌群的影響已有相關研究，結果顯示，砷污染土壤中微生物數量呈現下降趨勢，并與砷含量呈顯著負相關[8，13]。砷污染也能影響土壤微生物多樣性，改變土壤微生物群落結構[14]。

本研究利用Illumina Miseq高通量測序法從分子水平定量分析了不同外源砷脅迫下根際土壤中微生物群落結構的組成、豐度、遺傳多樣性，采用聚類分析、PCA主成分分析等手段，對不同處理樣本微生物的群落組成進行了深入探究。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與試驗設計

1.1.1 樣品前處理 本研究土壤樣品于2016年3月采集于山西省某污灌區，共選取了6個采樣點位，每個點位分別取距地表0～20 cm深度的土壤樣品2 kg，將所采集的土壤樣品風干后充分混合均勻，去除土壤中的植物殘體和石子磚塊等雜物，用木棍和瑪瑙研缽研磨后過2 mm篩備用。

將自然風干的、過2 mm篩的備用土壤平均分成3組，記為A、B、C。向B、C 2組中分別添加配制好的NaAsO2溶液，使B組、C組土壤中的總砷含量分別達到20、40 mg/kg，并用消毒后的筷子攪拌，使其混合均勻，以獲得低濃度梯度和高濃度梯度砷污染土壤。將砷污染土壤再次自然風干，過2 mm篩后裝入塑料保鮮盒中。將處理好的土壤在室溫下進行培養，培養時間為1年。期間每隔7 d查看土壤情況，若土壤缺水，則適當添加一定量去離子水。培養完成后測定土壤理化性質及總砷、有效態砷含量。

1.1.2 試驗設計 供試土壤培養1年后，將3組土壤樣品分別風干研磨，混合均勻，過2 mm篩備用。選取14.5 cm×11.0 cm×17.0 cm的聚乙烯塑料盆為試驗用花盆，稱取過篩土壤樣品1 kg放入花盆中，每組土壤花盆做3個平行試驗，其中不加外源砷的花盆編號分別為A1、A2、A3；土壤砷含量為20 mg/kg的花盆編號為B1、B2、B3；土壤砷含量為 40 mg/kg 的花盆編號為C1、C2、C3。購買市售油菜種子，挑選飽滿均勻無明顯損傷的種子在10%的H2O2消毒30 min，用蒸餾水沖洗干凈后浸泡在飽和CaSO4中2 h，用自來水和蒸餾水沖洗干凈后待用。將處理好的油菜種子種植到花盆中，每盆種植10顆種子，待發芽記錄發芽率后，間苗留5株，每天早晚2次稱質量添加水分，保持土壤濕度。植物生長40 d后收割，利用Miseq高通量測序法研究外源砷添加對土壤微生物群落結構和多樣性的影響。

1.2 土壤理化性質和砷測定方法

土壤pH值采用電位法測定(水土比為2.5 ∶1)；土壤有機質含量采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化-容量法測定[15]；土壤全氮含量采用凱氏定氮法測定；土壤全磷含量采用鉬銻抗比色法測定；土壤含水率采用烘干法測定。土壤總砷采用王水消煮法提取；土壤有效砷采用0.1 mol/L HCl提取法提取(液土比為 10 ∶1)[16]；土壤總砷、有效砷的含量均采用 ICP-MS 測定。

1.3 土壤微生物Miseq測序

1.3.1 DNA抽提 取0.5 g土樣，使用OMEGA公司生產的E.Z.N.AsoilDNA試劑盒，按說明書抽提，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

1.3.2 PCR擴增 真菌引物(SSU0817F：5′-TTAGCATGGA ATAATRRAATAGGA-3′；1196R：5′-TCTGGACCTGGTGAG TTTCC-3′)；細菌引物(515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′；907R：5′-CCGTCAATTC MTTTRAGTTT-3′)

PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應體系。2.0 μL 2.5×10-3mol/L脫氧核苷酸(dntps)，0.8 μL Forward Primer引物，0.8 μL Reverse Primer引物，4.0 μL 5×Fastpufu緩沖液，10 ng模板以及 0.4 μL Fastpufu聚合酶，補ddH2O到20 μL。

反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 s，27個循環；72 ℃延伸10 min。

每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

1.3.3 熒光定量 參照電泳定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

1.3.4 Miseq測序 根據Illumina Miseq測序平臺的標準流程進行雙端測序。

1.4 數據分析

將Miseq測序得到的PE reads首先根據overlap關系進行拼接，再根據PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接(merge)成1條序列，同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾，根據序列首尾2端的barcode和引物序列區分樣品，得到有效序列，并校正序列方向。過濾讀長尾部質量值20以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的讀長；根據雙端讀長之間的重疊關系，將成對讀長拼接成1條序列，最小重疊長度為10 bp；拼接序列的重疊區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；根據序列首尾2端的條形碼和引物區分樣品，并調整序列方向，條形碼允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2；且去掉包含模糊堿基的序列。

區分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學分析，基于OTU可以進行多種多樣性指數分析，基于OTU聚類分析結果，可以對OTU進行多種多樣性指數分析，以及對測序深度進行檢測；基于分類學信息，可以在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。在上述分析的基礎上，可以對樣本的群落組成進行多元分析和差異顯著性檢驗等一系列統計學和可視化分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質、總砷、有效砷含量

土壤基本理化性質、總砷、有效砷含量見表1，從表1可以看出，3組土壤均呈弱堿性。

表1 供試土壤基本理化性質

土壤中總氮、總磷、有機質的含量與添加外源砷濃度的變化趨勢相同，即隨著外源砷濃度的升高，總氮、總磷、有機質的含量逐漸增加。

土壤中總砷含量和有效砷含量均隨著土壤中外源砷添加量的增加而增加，其中B、C點位總砷含量(pH值>6.5，旱地)超過國家土壤環境質量三級標準(GB 15618—1995《土壤環境質量標準》)，分別為質量標準的1.04倍、2.08倍，且B、C點位有效砷含量為A點位的1.20倍、1.63倍。同時土壤中有效砷含量占總砷的比例呈下降趨勢。

2.2 土壤細菌群落結構分析

2.2.1 土壤細菌群落豐富度和α多樣性分析 對不添加外源砷(A1、A2、A3)、添加低濃度外源砷(B1、B2、B3)、添加高濃度外源砷(C1、C2、C3)等不同處理條件下3組土壤樣品進行MiSeq測序，經去雜優化共得到318 542條有效序列，平均每個樣品的有效序列為35 394條；有效堿基數目為 126 410 768，占原始總堿基數目159 908 084的79.05%，平均每個樣品為14 045 641，平均長度為396.841 496 1。不同處理條件土壤樣品細菌測序序列長度分布在381～420范圍內，其中大多分布于381～400之間。以97%的相似水平劃分標準OTUs，依據所劃分OTUs，對不同處理下的細菌做α多樣性分析，通過計算豐富度指數和多樣性指數，分析不同濃度梯度砷污染對細菌豐富度和多樣性的影響。細菌群落豐富度指數用Ace指數和Chao1指數表示，其值越高說明群落物種豐富度越高[17-18]；樣品的多樣性程度用Shannon指數表示，Shannon指數越高，表明土壤細菌群落多樣性越高[19]；Simpson指數能反映物種的優勢度[17，20]，Simpson指數值越大代表菌群多樣性越低；Coverage覆蓋度指數主要用于指示物種覆蓋度表。不同砷濃度處理條件下土壤細菌豐富度和多樣性分析結果見表2。

從表2可以看出，不同處理條件下，細菌豐富度指數和多樣性指數有明顯差異。對土壤豐富度指數而言(Ace指數和Chao1指數)，未添加外源砷土壤細菌豐富度指數最高，高濃度砷污染土壤中細菌豐富度指數最低。未添加外源砷條件下，Ace指數和Chao1指數范圍分別為1 698.571～1 743.115、1 719.505～1 772.841；高濃度砷污染土壤條件下，Ace指數和Chao1指數范圍分別為1 376.947～1 420.341、1 306.883～1 448.328。結果表明，隨著土壤中砷濃度的提高，土壤中細菌的豐富度指數降低。對多樣性指數而言，隨著外源砷添加量的提高，土壤中細菌的Shannon指數減小，Simpson指數增大，表明隨外源砷添加量提高，土壤細菌群落的多樣性降低。此外，本次測定3組數據的Coverage覆蓋度指數均接近于百分之百，表明本次測序基本捕捉到了試驗區土壤的全部物種信息，能真實反映各灌溉模式下真菌的群落結構。結果表明，外源砷添加降低了土壤細菌群落的豐富度和多樣性，且添加量越高，對土壤細菌的豐富度和多樣性抑制性越強。

表2 97%相似度水平上的細菌α多樣性分析

2.2.2 土壤物種多樣性曲線 為了進一步分析測序數據的合理性，對土壤樣品進行稀釋曲線分析。曲線走勢平坦表示更多的數據量只會產生少量新OTUs，以此說明測序數據量合理，并且間接反映物種的豐富程度。本研究所有土壤樣品在相似度97%條件下的稀釋性曲線見圖1。

從圖1可以看出，當測序量數據超過15 000之后，稀釋曲線逐漸趨于平緩，基本達到飽和，同時相似度為97%條件下測得的樣品覆蓋度在0.981 7～0.992 4，表明目前的細菌樣本測序量數據基本合理，能夠真實有效反映不同砷濃度污染條件下土壤中細菌的種類和結構，只有少量細菌群落未被發現。對比不同組別的曲線可知，不同處理條件下根際土壤中細菌OTUs數量呈現以下規律：未添加外源砷(A1、A2、A3)>添加低濃度梯度外源砷(B1、B2、B3)>添加高濃度梯度外源砷(C1、C2、C3)，表明隨著外源砷濃度的升高，對土壤中細菌群落產生影響，但對不同土壤中的影響不同。結果表明，不同處理條件下細菌的稀疏性曲線分析與細菌α多樣性分析結果一致。因此，外源砷能夠脅迫影響土壤細菌的豐富度及其多樣性。

2.3 土壤細菌類群分析

2.3.1 土壤微生物群落組成總體特征 對土壤樣品的細菌16S rRNA基因進行了MiSeq測序和分類學分析，分類結果見圖2，研究區土壤有細菌33門、70綱、164目、282科以及397屬。其中細菌門(phylum)主要包括變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)，占所有土壤樣品細菌總量的90%以上，除上述細菌門類外，土壤樣品中還檢測到裝甲菌門(Armatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、Latescibacteria和熱袍菌門(Thermotogae)等的存在，但豐度較低，占細菌總數不足10%。可以看出，研究區土壤中占主導地位的細菌門為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)，說明這幾類菌群對研究區環境有較強的適應性。

分析結果還顯示，各樣品中還有少量序列未被分歸到任何現存的門類中，占序列總數不足2%，說明研究區土壤中還有未被認知的菌種資源。在優勢菌門中，變形菌門(Proteobacteria)在各樣品中所占的比例范圍為13.86%～28.90%，酸桿菌門(Acidobacteria)在各樣品中所占的比例為16.56%～24.09%，放線菌門(Actinobacteria)在各樣品中所占的比例為9.63%～28.73%，這3個門的菌群在樣本群落結構中占主導地位，其中，豐度最大為變形菌門(Proteobacteria)。

2.3.2 不同砷處理條件下土壤細菌群落組成及分布差異分析 采用貝葉斯算法對97%相似水平的OTU序列進行分類分析。從圖3可以看出，不同砷污染濃度梯度條件下土壤中優勢菌的結構和相對豐度存在差異。在細菌門分類水平上，未添加外源砷土壤(A1、A2、A3)、添加低濃度外源砷土壤(B1、B2、B3)、添加高濃度外源砷土壤(C1、C2、C3)在細菌菌落種類上的差別并不顯著。在3種不同外源砷濃度處理方式下，研究土壤中主要包括變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)，這幾類細菌為優勢菌，所占相對豐度較高，且在該類型處理土壤中變形菌門(Proteobacteria)所占豐度最高；其次是放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)。此外，浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)等菌門所占豐度也較高。

但是，3種不同的處理方式在細菌的相對豐度上有差異性，相比而言，未添加外源砷的土壤中變形菌門(Proteobacteria)相對豐度較添加外源砷的土壤中比例明顯降低，而酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)在土壤中的豐度表現出相反的趨勢，未添加外源砷的土壤中這2種菌門的相對豐度明顯低于添加外源砷土壤，可能是因為不同菌門對砷的脅迫能力不同 。

由圖3可看出，3種不同濃度外源砷處理土壤中的優勢類群在門水平下的變化水平各不相同。隨著土壤中添加外源砷濃度的升高，在門水平下土壤中的優勢類群變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)所占的相對豐度基本呈現逐漸增加的趨勢，而放線菌門(Actinobacteria)呈現出相反的變化趨勢。因此，不同門的細菌類群對外源砷的耐受程度不同，隨著外源砷濃度的升高，最終細菌菌門的相對豐度表現出不同的變化趨勢。

2.3.3 OTU水平細菌的β多樣性分析 通過Bray-curtis距離，對土壤樣品進行樹狀圖(圖4-A)和主坐標分析(圖4-B)，二者的結果基本相同。圖4-A為對原始土壤和添加不同濃度外源砷之后土壤環境中細菌的聚類情況，結果顯示，未處理土壤和不同濃度外源砷處理的土壤聚類成2個類型，且差異較大，表明2種處理之間的OTU種類存在差異，說明不同濃度的外源砷對細菌的OTU種類有影響，平行之間的差異不明顯。

主坐標分析表明(圖4-B)，第1坐標闡述了OTU水平細菌菌落結構52.84%的變異，在PCoA1上A和B、C這2種土壤明顯分開，由于2種不同濃度外源砷處理的土壤存在差異，表明不同濃度的外源砷是導致土壤細菌菌落變異的最主要因素。第2坐標闡述了OTU水平細菌菌落結構17.25%的變異，在PCoA 2上A、B、C不同處理土壤中的細菌菌落結構均存在差異，處理A、處理C之間差異不明顯，處理B、處理C之間差異明顯，表明PCoA 2坐標也與外源的添加有關。因此，對于土壤細菌菌落結構的變異也源于外源砷的影響。結果分析表明，外源砷對土壤細菌的多樣性影響明顯，并且高濃度外源砷對土壤細菌多樣性的影響更加明顯。

3 討論與結論

3.1 外源砷添加對土壤中有效態砷含量的影響

當外源砷進入土壤環境中后，首先會參與土壤環境中的吸附解吸的過程，并且多種環境因素影響pH值、氧化還原電位(Eh)、外源砷濃度、環境溫度、土壤質地、礦物組分等土壤介質對砷的吸附能力，土壤環境中的砷濃度越高，越容易把其他離子從膠體等上置換下來[21]。李道林等的相關研究指出，在土壤中添加不同濃度的外源砷之后，土壤中砷各種形態均隨外源砷的含量的增加而增加[22]，本研究結果與此相似，并且在土壤中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)都以陰離子形式被吸附。

相關研究指出，有效態砷在土壤中占總砷的比例很少，并且以可溶性砷或者吸附在土壤膠體表面的砷的形式存在[23-25]，本研究中3個不同處理的有效態砷占總砷的比例分別為6.285 7%、1.980 7%、0.578 3%，即隨著外源砷添加濃度的升高，土壤中有效態砷所占的比例逐漸減少。高雪等的研究指出，外源砷進入土壤伴隨陳化過程，有效態砷的含量呈現逐漸下降趨勢[26-27]，本研究結果與此相似，并且土壤pH值呈堿性，土壤中的負電荷吸附位點增加，而且土壤中的砷都以陰離子形式被吸附，此外土壤膠體對于外源砷的吸附及其轉化產物的吸附、固定是個長期、復雜、緩慢的過程。

3.2 外源砷添加對土壤中細菌群落組成與類群差異的影響

外源砷不僅使土壤中總砷含量增加，亦使土壤中有效態砷含量明顯增加。利用Miseq高通量測序技術分析結果顯示，土壤中砷含量的增加明顯抑制了土壤細菌的豐富度和多樣性。隨著砷污染的加劇，土壤中Shannon-Wiener 指數和豐富度指數均顯著性降低，張雪晴等研究發現重金屬污染程度的加大，將引起細菌物種數量的下降，并導致細菌群落多樣性降低。本研究結果與之一致。

蔣德明等研究發現，砷污染土壤中變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)菌群豐度較高，本研究結果與之一致。砷污染程度的不同直接影響著細菌的相對豐度，這可能是由于不同菌門對砷的脅迫能力不同所造成，Lorenz等研究結果，砷污染土壤中微生物群落變化發現，變形菌門(Proteobacteria)與酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)相比，其對砷有更強的耐受能力[28-30]。研究表明，變形菌門(Proteobacteria)中部分種屬含有三價砷氧化基因(aioA和arrA)、五價砷還原基因[ACR3(1)]和將三價砷外排出體內的基因(arsB)，這些基因的存在使得微生物對砷具有較高的耐性，從而可以長期在砷污染或高砷污染的土壤或沉積物中形成優勢種群[31-33]。

本研究以山西省某污灌區土壤及不同濃度的外源砷處理土壤為環境樣本，研究利用Miseq高通量測序技術系統地分析了3種不同濃度的外源砷對污灌區土壤中細菌群落結構的變化和特點。通過比較分析，明確污灌區土壤細菌群落對高濃度外源砷的適應機制，為灌區砷污染土壤的生物修復提供技術支持及指導。主要有以下結論：(1)砷污染程度的加大，將引起細菌物種數量的下降，并導致細菌群落豐富度和多樣性降低；(2)污染土壤中變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)菌群豐度較高，不同菌門砷的脅迫能力不同，促使不同砷污染土壤中細菌的相對豐度不同。