喹諾酮類膠體金檢測試劑板的研發及在水產品中的應用

謝世紅，王偉萍，孟 霞，胡葉軍，陳笑笑，銀旭紅，劉 彬

(1.江西省水產技術推廣站，江西南昌 330046； 2.杭州南開日新生物技術有限公司，浙江杭州 310051)

喹諾酮類藥物(guinolones，簡稱QNS)是繼磺胺藥之后迅速發展起來的一類十分重要的人工合成抗菌藥物，因其具有抗菌譜廣、組織穿透力強、高效低毒、價格低廉等優點，被廣泛用于動物的多種感染性疾病的預防和治療[1]。該類藥物在動物體內消除緩慢，過量或不當使用會造成動物產品中殘留和蓄積，人類長期食用含有喹諾酮類藥物殘留的水產、禽畜肉及禽蛋等動物源性產品后，可能導致細菌耐藥性問題，以及對中樞神經系統造成不良反應[2-3]。

鑒于氟喹諾酮類藥物在食品中殘留對人類健康的危害，食品添加劑聯合專家委員會(JCEFA)制定了達氟沙星在牛、豬、禽的最高殘留限量(MRLs)；歐盟委員會制定法規規定了氟喹諾酮類藥物的最高殘留限量；美國食品及藥物管理局(FDA)則將氟喹諾酮類作為禁止使用的藥物；我國農業部在235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》也對氟喹諾酮類抗菌藥在動物性食品中的最高殘留限量作了規定。

目前，喹諾酮類藥物的檢測方法主要包括：微生物分析法[4]、熒光光度法[5]、毛細管電泳法[6]、液相色譜-串聯質譜法[7]、酶聯免疫法[8]等。膠體金免疫層析法是20世紀90年代新興的一種新型免疫學檢測技術，其反應所需要原料的全部或大部分均已整合到試劑板中，不僅試劑攜帶方便，試驗操作簡單，肉眼即可直接判定結果，并且還有準確度高、特異性強的優點，目前已越來越廣泛運用于食品安全中藥物殘留的檢測。

1 材料和儀器

1.1 材料和試劑

1.2 儀器

BioJet XYZ 3 000型點膜儀，購自美國BioDot；UV-752紫外-可見光分光光度計，購自美國UNICO公司；Avanti J-26XP高速冷凍離心機，購自美國Becman公司；恒溫鼓風干燥箱，購自上海精宏實業設備有限公司；切割機，購自杭州市恒通設備有限公司；膠體金讀數儀，購自杭州南開日新生物技術有限公司；78HW-1恒溫磁力攪拌器，購自杭州儀表電機有限公司。

2 試驗方法

2.1 金標抗體溶液配制

取1 L膠體金溶液(顆粒直徑40 nm左右)使用K2CO3及HCl調整至最適標記pH值后，加入適量環丙沙星多克隆抗體，過夜穩定后加入5% BSA至BSA最終質量分數為1%，離心純化后沉淀用0.01 mol/L PB溶液(含1% BSA和 0.05% NaN3)重懸，4 ℃保存備用。

2.2 試劑板的組裝和樣本處理方法

組裝：取稀釋好后的CIP-EDC-OVA和羊抗兔IgG適量噴于NC膜上，分別形成相距0.5 cm的檢測線(T線)和質控線(C線)，37 ℃烘箱干燥2 h；將金標抗體溶液按3 μL/cm噴至玻璃纖維上作為金標結合墊，置于37 ℃烘箱干燥2 h；分別將樣品墊、金標結合墊、NC膜、吸水墊黏于PVC板上，使用切割機切成3 mm寬度的試劑板，裝入塑料模板中壓成試劑板(圖1)。

樣本處理：取2 g勻質樣本于5 mL離心管中；加入3 mL提取劑，劇烈振蕩3 min后，室溫下4 000 r/min離心5 min；移取上層溶液1 mL于新5 mL離心管中，65 ℃ 下氮(空)氣吹干；向吹干的離心管中加入0.3 mL正己烷和0.3 mL PBST溶液，上下顛倒混勻1 min，靜置分層后吸取下層溶液0.1 mL，垂直滴加至試劑板樣品槽中，3～5 min后讀取結果。

結果判定：使用金標讀數儀讀取，T、C線值，分別代表T、C線上膠體金顆粒的多少。本試劑板采用對比法判定，若檢測線(T線)顯色淺于控制線(C線)顯色，則判定為陽性；若檢測線(T線)顯色深于控制線(C線)顯色，或者顯色一樣深，則判定為陰性；若控制線(C線)沒有顯色，檢測線(T線)無論有無顯色，均判定為無效板。

2.3 試劑板干燥時間的優化

NC膜上CIP-EDC-OVA及羊抗兔IgG包被完成后放入37 ℃烘箱干燥，每隔一段時間后取出組裝成試劑板，使用PBST溶液滴定，觀察并記錄結果。

2.4 試劑板靈敏度

分別使用PBST溶液稀釋環丙沙星標準品溶液至0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 μg/L，滴板檢測并記錄試驗結果。

2.5 試劑板特異性

取環丙沙星及同類化合物標準品，PBST溶液稀釋成梯度濃度后分別使用試劑板檢測，記錄靈敏度數值。

2.6 提取劑優化

取陰性魚樣、2 μg/kg環丙沙星添標魚樣，分別使用乙腈、酸性乙腈(2 mol/L HCl，2%V/V)、堿性乙腈(2 mol/L NaOH，2%V/V)、二氯甲烷、乙酸乙酯作為提取劑，按照步驟“2.5”節進行樣本處理后檢測，統計結果。

2.7 試劑板的檢出限

取陰性魚肉樣本添加環丙沙星至最終質量分數分別為0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 μg/kg，使用乙腈提取后檢測并記錄試驗結果，每個濃度設6個重復。

2.8 試劑板檢測與液相色譜-串聯質譜法的符合率

取不同批次的魚樣、蝦樣分別使用液相色譜-串聯質譜法及本試劑板檢測，比較試驗結果。

3 結果與分析

3.1 試劑板干燥時間的優化

分別在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、24.0、48.0、72.0 h的時間點取出試劑板，使用PBST檢測。由表1可知，試劑板在2 h時，T/C值已趨于穩定，當試劑板干燥時間為24 h時，T、C線顯色趨于穩定。

表1 干燥時間對試劑板的影響

3.2 試劑板靈敏度

由圖2可知，當環丙沙星濃度低于2 μg/L時，試劑板顯色結果為陰性；當環丙沙星濃度≥2 μg/L時，試劑板顯色結果為陽性。故試劑板的靈敏度可為環丙沙星2 μg/L。

3.3 特異性試驗

各類化合物的靈敏度見表2。本試劑板對15種喹諾酮類藥物均有反應，靈敏度在1～20 μg/L不等，具有良好的廣譜性；同時與其他抗生素如四環素、磺胺二甲基嘧啶、氯霉素在2 mg/L的濃度下無反應，具有較好的特異性。

表2 試劑板特異性試驗

3.4 提取劑優化

由表3可知，乙腈、酸性乙腈、堿性乙腈、二氯甲烷提取時陰性和陽性結果顯色明顯，梯度大小適中，均可作為提取劑使用，考慮到提取劑簡化及二氯甲烷毒性較大，故采用乙腈作為提取劑。

3.5 檢出限

由表4可知，環丙沙星的檢出限為2.0 μg/kg。樣本處理過程中，提取過程中標準品先從2 g樣品中萃取至3 mL乙腈中，又由1 mL乙腈經過吹干復溶于0.3 mL PBST中，理論上提取過程環丙沙星濃度濃縮至原來的2倍以上，而檢出限和靈敏度的結果一致，故提取效率及樣品基質等對試劑板的檢出限有一定的影響。

表3 提取劑優化試驗

注：梯度即同等方法檢測2 μg/kg環丙沙星添標樣品與陰性樣本時T/C值的差。

表4 樣品檢出限試驗(n=6)

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。下表同。

3.6 與液相色譜-串聯質譜法(LC-MS)的符合率

試劑板與液相色譜-串聯質譜法的符合率詳見表5。針對不同陰陽性樣本，試劑板的檢測結果與LC-MS結果一致，符合率100%。

表5 試劑板與液相色譜-串聯質譜法(LC-MS)檢測結果的符合情況(n=6)

4 討論

喹諾酮類藥物種類繁多，藥效作用明顯，因此現已成為最常見的濫用藥物之一。2015年下半年農業部獸藥殘留監測計劃共檢測畜禽產品7 000份，不合格樣品6批，全部為氟喹諾酮類藥物超標[10]。我國國標檢測方法主要使用液相色譜-串聯質譜法，該方法雖然精確度高，但存在儀器設備昂貴、操作復雜、操作周期長等問題，不利于在基層養殖企業、監管單位推行。目前，我國食品安全日益得到重視，水產品、畜禽等農產品產地準出制度、市場監管制度日益完善。因此，簡單、快速、準確的快檢方法將更有利于在基層推廣，具有較大的市場需求。

本研究建立了1種檢測喹諾酮類藥物的免疫膠體金試劑板，并應用于水產品的檢測。該試劑板能同時檢測15種喹諾酮類藥物，靈敏度為1～20 μg/L，準確度高，適用于養殖企業、監管單位對樣品的大規模篩查。