馬鈴薯黑痣病生防芽孢桿菌的篩選與鑒定

朱明明，張 岱，趙冬梅，潘 陽，朱杰華，楊志輝

(河北農業大學植物保護學院，河北保定 071000)

馬鈴薯黑痣病是由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的一種土傳性真菌病害，該病害既可通過土壤傳播，也可通過帶病種薯傳播[1]，在世界各國馬鈴薯主產區均普遍發生，嚴重影響馬鈴薯的產量和品質[2]。近年來，馬鈴薯種植面積逐漸擴大，難以進行輪作倒茬，導致土壤中立枯絲核菌逐年累積，馬鈴薯黑痣病對我國馬鈴薯外觀品質影響嚴重。據報道，內蒙古地區馬鈴薯黑痣病發病嚴重的地塊發病率可達 70%～80%[3]，植株幼苗的死亡率高達60%[4]，嚴重制約我國馬鈴薯產業的可持續健康發展。

目前，馬鈴薯黑痣病仍以化學防治為主，但化學藥劑的頻繁使用會導致病原菌產生抗藥性，造成農藥殘留和環境污染[5-6]。我國農業現代化發展方向是綠色可持續發展，因此利用生物源藥劑來防控病害符合我國當今和未來的農業發展趨勢。當前，有機改良劑[7]、有益微生物[8]、植物藥劑和生防因子[9]等環境友好型生防藥劑的開發成為防治土傳病害的研究熱點。相關研究表明，寄生性真菌綠色黏帚霉(Gliocladiumvirens)和木霉屬(Trichodermaspp.)[10-12]、輪枝菌(Verticilliumbiguttatum)[13-15]能夠破壞立枯絲核菌的菌絲和菌核，從而降低馬鈴薯黑痣病的發生。此外，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)[16]、多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)[17]等細菌也能夠有效防治馬鈴薯黑痣病。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是土壤和植物微生態系統中的優勢微生物群體，能夠產生不同的抗真菌化合物，有利于植物生長并誘導其產生抗性；此外，還能產生耐熱抗逆的芽孢，具有很強的生存繁殖能力，有利于生防菌劑的開發[18-19]。芽孢桿菌有益菌株已用于如稻瘟病[20]、小麥赤霉病[21]、小麥根腐病[22]、蘋果輪紋病[23]等多種植物病害的防控研究。針對馬鈴薯病害的研究多集中于幾種馬鈴薯細菌病害如馬鈴薯黑脛病和軟腐病[24]、馬鈴薯環腐病[25]，對于馬鈴薯黑痣病的生防芽孢桿菌，僅見枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) XC5[17]和萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)D1-0-1和D1-0-2[26]。因此，進一步篩選出適合我國不同區域的芽孢桿菌菌株對于防治黑痣病具有重要意義。

本研究從河北省和內蒙古自治區馬鈴薯連作試驗田采集的馬鈴薯根際土中篩選對黑痣病生防效果好的芽孢桿菌，進行盆栽防效試驗，以期為今后馬鈴薯黑痣病優良生防菌劑的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究所用生防菌株均由本試驗分離獲得，指示菌株立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)分離自馬鈴薯黑痣病塊莖，保存于河北農業大學馬鈴薯病害研究中心。

1.2 根際土壤樣品的采集

從河北省和內蒙古自治區馬鈴薯連作試驗田采用5點取樣法取馬鈴薯黑痣病發病嚴重的植株周圍的健康植株根際 0～20 cm的土壤，混合均勻，裝入自封袋帶回實驗室，4 ℃保存備用。

1.3 馬鈴薯黑痣病生防芽孢桿菌的分離和篩選

采用土壤稀釋法分離土壤中的芽孢桿菌[27]，以平板對峙法[28]篩選對馬鈴薯黑痣病具有生防效果的菌株：將25 ℃培養3 d的立枯絲核菌菌餅(直徑5 mm)置于PDA培養基中央，取供試芽孢桿菌菌懸液5 μL分別接種于距立枯絲核菌菌餅2.5 cm處的無菌濾紙片上，以接無菌水為對照。放置在28、15、10 ℃進行培養，待對照長滿平板，測量抑菌帶寬度。

1.4 生防芽孢桿菌的鑒定

1.4.1 生防菌的培養特征和形態特征 參照范秀容等的方法[29]，將所篩選的菌株劃線接種于LB平板，于37 ℃恒溫培養箱培養24 h后，觀察菌落形態并進行革蘭氏染色。

1.4.2 生防菌的分子鑒定 采用細菌Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取生防菌DNA，并用引物gyrB-F(5′-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3′)和gyrB-R(5′-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3′)進行gyrB序列擴增[26]。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，送上海生工生物工程有限公司測序。將測得的序列與GenBank中核酸序列進行BLAST同源序列比對，下載同源性大于98%的序列，利用ClustalX進行多重序列比對，切除兩端不齊的部分，用MEGA(6.06)以鄰接法構建系統發育樹，Bootstrap置信值估算重復次數為1 000次。

1.5 生防菌對馬鈴薯黑痣病的盆栽防效試驗

1.5.1 生防菌發酵液的制備 將保存在-80 ℃的菌株劃線于LB平板上活化培養，挑取單菌落于LB液體培養基中，30 ℃、200 r/min培養20 h，按2%的接種量接種于40 mL/250 mL 的三角瓶中，培養2～3 d，調整菌液濃度至1.0×109CFU/mL，備用。

1.5.2 盆栽防效試驗 將麥粒培養基中培養20 d后的病原菌按2%的質量比接入盆中。試驗設計4個處理(表1)，每個處理10盆，重復3次。接種30 d后調查其出苗率、發病率，根據張建平等的分級標準[30]統計病害嚴重度，計算病情指數和防治效果。

出苗率=出苗數/播種數×100%；

發病率=發病數/出苗數×100%；

病情指數=∑(各級病株數×發病級別)/(調查數×最高級別)×100%；

防治效果=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數×100%。

表1 生防菌株HN-Q-8對馬鈴薯黑痣病的盆栽試驗處理

1.6 數據統計和分析

生防菌篩選和盆栽試驗數據采用SPSS V21.0進行方差分析，并采用Duncan氏新復極差法檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離及黑痣病菌拮抗菌株的篩選

通過土壤稀釋法從28個土樣中共分離到141株芽孢桿菌，以平板對峙法28 ℃培養篩選出12株對黑痣病菌(R.solani)具有拮抗作用的菌株，其抑菌帶寬度>5.0 mm(表2)。其中HN-Q-8、HC-X-21、NZ-9、NZ-7、FX、HC-W-162等6株芽孢桿菌對黑痣病菌(R.solani)具有很強的抑制作用(圖1)，其抑菌帶寬度為6.1～8.0 mm(表2)。

表2 芽孢桿菌對立枯絲核菌的抑制效果

注：數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 溫度對芽孢桿菌抑制黑痣病菌的影響

將篩選獲得的6株強抑制作用的芽孢桿菌分別放置于28、15、10 ℃與供試立枯絲核菌進行對峙培養，測定溫度對抑菌帶大小的影響。結果表明，28 ℃時供試6株芽孢桿菌的抑菌帶最寬；15 ℃時抑菌帶的大小急劇減小(圖2)。從表3可以看出，不同菌株抑菌帶減小量差異很大，菌株FX在28 ℃時抑菌帶寬度為 6.6 mm，在15 ℃時抑菌帶寬度為2.1 mm，減少了4.5 mm；溫度為15 ℃時，菌株HN-Q-8的抑菌帶寬度明顯高于其他菌株。而當溫度降為10 ℃時，所有菌株均無抑菌效果(圖2-C)，表明低溫抑制了芽孢桿菌的活力，從而使其喪失了抑菌效果。

2.3 生防菌株的培養和形態學特征

生防菌HN-Q-8等6個菌株在LB平板上37 ℃培養24 h后，菌落形態一致為圓形或橢圓形、乳白色，黏稠濕潤，菌落邊緣不整齊，表面有褶皺，不透明(圖3-A)。革蘭氏染色呈陽性，菌體呈桿狀并生有芽孢(圖3-B)。

表3 溫度對生防菌株抑制黑痣病菌效果的影響

注：同列數據后不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同行數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 生防芽孢桿菌的分子鑒定

本研究測定了HN-Q-8等6個菌株的gyrB序列，提交到GenBank，登錄號為：KY369915-KY369920，長度為911～927 bp。分別在GenBank中進行BLAST同源序列比對，下載21條相似性高于98%的序列，同源比對后，獲得長度為 899 bp 的gyrB基因數據組。以B.atrophaeus、B.subtilis、B.licheniformis和B.malacitensis作為外群構建系統發育樹(圖4)。該樹形成了3個分支，從上到下以阿拉伯數字表示。結合文獻和GenBank注釋分支1～3為解淀粉芽孢桿菌復合種。Dunlap研究表明，菌株JN86140為B.velezensis[31]，Agbobatinkpo等和Zhao等分別將菌株JX513952和JQ734538鑒定為Bacillusamyloliquefaciens[32-33]，因此分支1界定為B.velezensis，分支2界定為狹義的B.amyloliquefaciens，而分支3為一未命名的隱藏種。本研究中所測定的6個芽孢桿菌均聚在分支1中，因此我們將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)。

2.5 生防芽孢桿菌HN-Q-8對馬鈴薯黑痣病的盆栽防治效果

不同處理組接種培養30 d后，測定生防菌株對馬鈴薯黑痣病的防治效果。結果表明，生防菌灌根和浸種處理組的發病率和病情指數均低于病原菌對照組，且灌根處理低于浸種處理組(表4)；生防菌灌根處理對馬鈴薯黑痣病的防治效果高于浸種處理組，防效分別為61.22%和52.72%(表4)。

3 討論

應用有益微生物和微生物代謝產物被認為是防治植物病害的有效方法[34-37]。本研究從馬鈴薯根際土中篩選出6株對馬鈴薯黑痣病菌具有較強抑制效果的B.velezensis，其中菌株HN-Q-8對馬鈴薯黑痣病的防治效果最強。研究表明，B.velezensis能夠促進植物生長，防控植物病原菌，并且能夠誘導寄主產生抗性[31，38-39]。B.velezensisCC09產生的活性化合物對由大豆炭疽病菌、立枯絲核菌和鏈格孢引起的真菌病害具有防治作用，且促進植物生長[40-41]。Chen等發現B.velezensisFZB42產生的聚酮化合物對果樹火疫病具有防治作用[42]。此外，B.velezensis對白菜黑斑病菌[43]、番茄灰霉病菌[44]、蘭花枯萎病菌[45]等也具有較好的抑制作用。

本研究發現生防菌在不同的溫度下其防治效果不同，大體表現為溫度降低，生防效果減小，且不同菌株減小的程度不同。在10 ℃時供試芽孢桿菌對黑痣病菌均無任何抑制作用，而馬鈴薯在5 ℃以上即可發芽，10 ℃即可生長，同時黑痣病菌10 ℃也可生長，而此時供試芽孢桿菌無防病作用。因此，在今后利用芽孢桿菌防控黑痣病時，應注意播種前期結合噴施化學藥劑方能在后期表現出其對黑痣病的防控作用。本研究中菌株HN-Q-8和HC-X-21在28 ℃時對立枯絲核菌的抑制作用無明顯差異，但當溫度降至15 ℃時，其抑菌效果差異顯著。因此，為了更好地發揮早期溫度較低時生防菌株的防病效果，應選擇受溫度影響較小的菌株。

表4 菌株HN-Q-8對馬鈴薯黑痣病的盆栽防治效果

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。