甘藍型油菜BnNPR1的序列及其環境信號響應分析

李 霄，陳 婷，鮑玲莉，譚小力，張志燕，王 政

(江蘇大學生命科學研究院，江蘇鎮江 212013)

NPR1(nonexpressor of pathogenesis-related genes 1)是一個調控植物防衛反應的關鍵基因，在植物抗逆脅迫的生理活動中具有重要的作用。NPR1最早從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中克隆獲得，研究發現，這個基因不僅在擬南芥系統獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)[1]和誘導系統抗性(induced systemic resistance，ISR)[2]中起核心調控作用，而且也在植物基礎抗性(basic resistance)[3]中起作用。例如，在擬南芥中，研究者發現植物重要防衛信號分子水楊酸(SA)強烈誘導NPR1的表達[4-5]，并且NPR1在細胞核中能夠與轉錄因子結合而促進防衛基因的表達[6]；Spoel等分析發現NPR1在調控SA和茉莉酸(JA)信號途徑的交聯中起重要作用[2]；在水稻(Oryzaesativa)中，SA介導的NPR1抑制脫落酸(ABA)誘導基因的表達[7]，以上表明NPR1在植物防衛反應中的重要地位與作用。

近年來，對NPR1在植物抗脅迫方面的研究也越來越多[8-11]。在擬南芥中，研究者發現npr1功能缺失突變體與野生型相比在低溫和高鹽處理條件下均不同程度延遲了植物的生長發育[12-14]；Zhang等在煙草中過量表達異源MhNPR1(MalushupehensisPamp. Rehd.)而增強了煙草對鹽和干旱脅迫的抗性[8，15]；Quilis等研究分析表明，在水稻中組成型表達AtNPR1使其對鹽和干旱脅迫具有更高的敏感性[16]。目前，有關于NPR1在抗逆功能中的研究主要集中在擬南芥、煙草以及水稻中，而在油菜中還未被研究或未見報道。

甘藍型油菜(BrassicanapusL.)是我國最重要的油料作物之一，在生長過程中經常受到各種外界環境脅迫的影響，嚴重影響油菜的生產。本研究以甘藍型油菜品種寧油12為研究材料，分離獲得油菜NPR1基因(BnNPR1)，然后探究其蛋白的亞細胞定位及組織特異性表達，并且調查BnNPR1在各種環境脅迫處理條件下的表達響應情況，以期為進一步研究其抗逆功能提供線索。

1 材料與方法

1.1 植物材料和菌種

本試驗所用到的植物材料分別為甘藍型油菜品種寧油12和本式煙草(Nicotianatabacumcv. Xanthinc)，均在光照培養箱中培養，培養條件為：25 ℃條件光照培養16 h，20 ℃條件下暗培養8 h，相對濕度60%～90%，光照度為44 μmol/(m2·s)。

大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101均為筆者所在實驗室保存菌種。

1.2 主要試劑

用于RNA提取的Trizol試劑盒購于Invitrogen公司，DEPC水購自北京索萊寶科技有限公司，反轉錄試劑盒HiScript Q RT(SuperMix for qPCR +gDNA wiper)和熒光定量PCR試劑盒AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix均購于南京諾唯贊生物科技有限公司；水楊酸購于華東化玻有限公司(CAS No：616-76-2)；甲基茉莉酸(methyl jasmonate，MeJA)購自Sigma-aldrich公司(cat No. 39，270-7)；脫落酸(abscisic acid，ABA)購于Sigma-aldrich公司(Cat. No.A4906)；乙烯前體ACC(1-aminocyclopropane carboxylic acid，ACC)購于Adamas Reagent公司(CAS No：22059-21-8)。

1.3 模擬生物激素和環境脅迫的化學處理[17]

選用4葉1心期長勢良好的油菜幼苗，將幼苗從土壤中取出后用水洗干凈，然后將其轉移至1/2 MS培養基中進行培養，在黑暗條件下20 ℃培養48 h，以去除外界環境等因素對試驗結果的影響，然后對其進行模擬不同環境條件下的脅迫處理。

1.3.1 生物激素處理 將上述預處理后幼苗的葉片剪下，選取大小基本相同且等量的葉片，在離體葉片上分別噴灑足量1 mmol/L SA(水楊酸)、0.1 mmol/L MeJA(甲基茉莉酸)、0.05 mmol/L ABA(脫落酸)和0.1 mmol/L ACC(乙烯前體)，封閉黑暗保濕處理0、3、6、9、12 h，對照則用滅菌雙蒸水噴灑作相同處理，然后分別將用激素處理的葉片相應的對照葉片做好標記，取出裝袋后迅速置于液氮中凍存，并于 -70 ℃ 冰箱保存。上述每種處理均進行3次生物學重復。

1.3.2 環境脅迫處理 低溫脅迫處理：取上述預處理油菜的根部置于另一100 mL 1/2MS培養基，在黑暗條件下將其置于4 ℃冰箱中模擬低溫進行脅迫處理。重金屬(鉻)脅迫處理：將預處理油菜的根部置于配制好的500 μmol/L的K2Cr2O7溶液中在黑暗條件下20 ℃培養；干旱脅迫處理：將預處理油菜的根部置于濃度為15%的 PEG-4000(PEG，聚乙二醇)溶液中模擬干旱，黑暗下20 ℃培養。鹽脅迫處理：將預處理油菜的根部置于濃度為 400 mmol/L 的NaCl溶液中模擬鹽脅迫，20 ℃黑暗培養。

1.4 植物葉片總RNA提取及cDNA擴增

采用液氮研磨法對植物葉片(不超過1 g)進行研磨制備，然后按照Trizol試劑盒說明書上的步驟對葉片總RNA進行提取。提取得到的總RNA溶于20 μL DEPC水中，從中取出0.2 μL 溶于5 μL DEPC水并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，RNA濃度使用OneDrop OD-1000+分光光度計測定。RNA的逆轉錄用4×gDNA wiper Mix迅速徹底去除基因組污染，然后按HiScript?兩步法RT-PCR/qPCR系列試劑盒進行反轉錄合成cDNA，最后得到總體積10 μL的cDNA溶液，置于-70 ℃冰箱中保存備用。

1.5 BnNPR1的序列克隆及生物信息學分析

根據已經報道的NCBI上公布的甘藍(Brassicaoleracea)NPR1(BoNPR1，Gene ID：106376036)的序列設計引物進行克隆，PCR引物序列為：F：5′-CTTGTCTCTTGGAGTTTTCAC-3′和R：5′-GAATGAGCCAACAATAGACAG-3′。擴增條件為：94 ℃ 10 min；然后94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，36個循環；最后72 ℃延伸10 min。擴增得到的目的片段使用GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后連接到pMD18-T Vector上，轉化大腸桿菌。PCR鑒定平板上的單菌落，將鑒定得到的陽性菌株提取質粒后送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序成功后命名為pMD18T-BnNPR1。使用ProtParam工具(http：//web.expasy.org/protparam/)分析上述擴增得到的BnNPR1蛋白的理化性質，如等電點、相對分子量等；Plant-mPLoc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)[18]用于預測蛋白質的亞細胞定位錨定序列；GeneDoc和MEGA軟件用于多序列比對分析；利用NCBI數據庫中CDD數據庫對目的蛋白的保守結構域進行在線分析預測。

1.6 農桿菌介導的煙草葉片瞬時轉化

1.6.1 pK7FWG2.0-BnNPR1亞細胞定位載體的構建 從甘藍型油菜寧油12的葉片中提取RNA，以反轉錄得到的cDNA作為模板，設計PCR引物F：5′-CACCATGGAGAC-CATTGCCGGATT-3′和R：5′-CCGACGCCGGTGAGAGGGTT-3′，將擴增完成后的目的條帶進行膠回收(去除終止子)并測定其濃度。依據Gate-way試劑盒的操作說明(在上游的5′端加入CACC目的是提高與入門載體的連接效率)，以1 ∶3的比例將回收的目的片段與pENTR/D-TOPO載體反應，得到入門中間克隆載體，轉化大腸桿菌后用LB培養基(50 mg/L 卡那霉素)進行抗性篩選，挑取單克隆搖菌后進行PCR鑒定，陽性克隆對應菌液送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并留存剩余菌液。取測序正確的菌液提取質粒，然后按照Gate-way LR試劑盒的說明書通過LR置換反應將BnNPR1從pENTR中間載體轉移至最終的植物表達載體pK7FWG2.0-eGFP上，LR反應完成后轉化大腸桿菌，PCR鑒定單菌落，將得到的陽性克隆命名為pK7FWG2.0-BnNPR1-eGFP。將該陽性克隆擴大培養后提取的質粒轉化至農桿菌GV3101中。菌種置于 -70 ℃ 冰箱保存備用。

1.6.2 煙草葉片的瞬時轉化 將含有pK7FWG2.0-BnNPR1-eGFP重組質粒的農桿菌GV3101活化，然后在搖床(28 ℃，200 r/min)中分別培養含有重組質粒、P19(一種抑制基因沉默的蛋白質)和PCX-IND-DsRed攜帶紅色熒光蛋白的核定位(marker基因構成的載體)的農桿菌，培養至D600 nm的值為0.6時，5 000 r/min離心5 min收集菌體，加入15～20 mL的甲基丙烯酸甲酯(MMA)溶液懸浮1次，第2次懸浮后用分光光度計調節其D600 nm值為1.2時，按照1 ∶1 ∶1的體積比混合3種農桿菌菌液，28 ℃暗室放置誘導3 h。選取生長4周大且長勢良好的煙草植株，在靠近煙草葉片葉脈部位下表皮扎孔，然后用去掉針頭的1 mL無菌醫用注射器吸取菌液，緊貼煙草葉片下表皮將菌液緩慢注入葉片，直至菌液將整片葉片都充滿為止。黑暗條件下將煙草置于不透光的密封箱內，保濕培養24 h，然后轉入光照培養箱中培養5 d后觀察。試驗進行3次重復。

1.6.3 亞細胞定位觀察 取上述注射5 d后的煙草葉片，用熒光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5)觀察并檢測熒光信號。分別用激發光波長為488 nm(發射波長為510～540 nm)檢測eGFP發出的綠色熒光，用激發光波長為543 nm(發射波長為580～584 nm)檢測核定位marker發出的紅色熒光。觀察時以空載體pK7FWG2.0-eGFP、PCX-IND-DsRed和P19的混合菌液為對照。

1.7 實時熒光定量PCR

選擇使用內參基因B.napusTIP41(BnTIP41，油菜數據庫登錄號：Bra011516)，設計引物為：F：5′-TGAAGAGCAGA-TTGATTTGGCT-3′；R：5′-ACACTCCATTGTCAGCCAGTT-3′；根據目的基因BnNPR1設計引物序列為：F：5′-TCCAAC-ATACACAAGGCGCT-3′和R：5′-CATCGCAATACGCAACA-GCA-3′。熒光定量反應體系根據AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix試劑盒的說明書配制。依據說明書該試劑一般采用兩步法程序進行反應，即退火/延伸設置為60 ℃，反應40個循環；在每個循環的60 ℃收集熒光信號，通過每一個循環熒光信號的變化得到擴增產物的熔解曲線，以反應的CT值落在20～28之間的定量最為準確。每組試驗均要進行3個生物學重復，同時每個生物學重復至少需要進行3次技術重復。數據處理參考Wang等[19]的2-ΔΔCT計算方法，將數據輸出后得到的BnTIP41和BnNPR1的CT值轉化為基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 甘藍型油菜BnNPR1基因的克隆與序列分析

根據甘藍NPR1(BrassicaoleraceaNPR1，BoNPR1)的核苷酸序列CDS區的外側設計上下游引物，以油菜品種寧油12的總cDNA為模板進行PCR擴增，獲得單一的1 892 bp的擴增片段。該序列最終的ORF框長1 740 bp，終止密碼子TAG，編碼含有579個氨基酸殘基的蛋白質(圖1)。與其他植物NPR1氨基酸序列進行同源性比較發現，其所編碼的蛋白與雙子葉植物擬南芥、辣椒、煙草和單子葉植物葡萄、玉米、水稻等6個物種的NPR1在氨基酸水平上有較強的保守性，與AtNPR1的一致性達到73%(圖2)，進而，NCBI的CDD(conserved domain database)Search搜索比較發現，與其他植物的NPR1類似，其蛋白序列含有NPR1_like_C superfamily保守功能域(圖3)，同時還具有BTB domain和Ankryin repeat domain蛋白相互作用功能位點。這些分析表明，本試驗克隆得到的是NPR1在甘藍型油菜中的同源基因即BrassicanapusNPR1(BnNPR1)。

2.2 BnNPR1的亞細胞定位

蛋白質在細胞中不同位置的定位與其相應的生物功能相關。為了研究BnNPR1蛋白的亞細胞定位，筆者構建了植物表達載體pK7FWG2.0-BnNPR1-eGFP，并且利用農桿菌介導的煙草瞬時表達系統進行探測。結果(圖4)顯示，轉化載體的煙草葉片的細胞在綠色熒光激發下細胞核顯示為綠色，與細胞核核定位標記基因的RFP顯示的紅色重疊后顯黃色，表明BnNPR1定位于細胞核中。

2.3 組織表達分析

為了研究BnNPR1在油菜中各組織特異性表達情況，以油菜BnNPR1基因的全長cDNA為模板設計特異性引物，以BnTIP41為內參基因，利用熒光定量PCR技術對BnNPR1在油菜的根、莖、葉、花、角果等組織器官中的相對表達情況進行分析。結果表明，BnNPR1在根、莖、葉、花、角果中都有表達，其中在根中相對表達量最高，而在角果中表達量最少(圖5)。

2.4 BnNPR1在各種植物激素脅迫下的表達分析

已有的許多研究報道顯示，水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、乙烯(ET)等激素在調控植物防衛反應及抗逆脅迫中具有重要作用。為了研究BnNPR1是否與這些激素途徑相關或可能參與其中的途徑，筆者用上述植物激素或其類似物處理甘藍型油菜寧油12后，QRT-PCR分析結果顯示，SA、JA和ABA均可顯著激活BnNPR1的表達，但激活程度不同，而ET對其表達影響不明顯。SA處理后BnNPR1的表達量極顯著提高，特別是在6 h時表達上調到未處理時的近20倍；在JA和ABA處理后，BnNPR1也有上調表達；而在ET處理后，BnNPR1的表達量未發生明顯變化(圖6)。這些結果表明，BnNPR1是激素SA、JA和ABA的響應因子，BnNPR1可能在調控植物防衛反應及各種環境脅迫中，主要參與到SA和JA相關的信號網絡中。

2.5 BnNPR1在各種環境因子脅迫下的表達分析

在模擬低溫、重金屬、干旱、高鹽這4種環境因子脅迫處理條件下，調查甘藍型油菜BnNPR1基因的表達情況。結果如圖7所示，在低溫處理1 h時BnNPR1的表達量顯著上調；在PEG溶液處理3 h時BnNPR1的表達也上調明顯。與此同時，在K2Cr2O7溶液和低溫處理的條件下，BnNPR1的表達量也出現較明顯的變化。由這些結果可知，BnNPR1是低溫、重金屬、干旱、高鹽等各種環境脅迫因子的響應基因。

3 討論與結論

油菜是重要的油料作物，在食品、冶金、機械等多種行業應用廣泛，經濟價值高[20]。不良的環境條件會對植物生長產生不好的影響，甚至嚴重時會威脅到油菜的正常生產。目前，有關NPR1的研究主要集中在擬南芥、煙草以及水稻中，而關于NPR1在甘藍型油菜中還未有研究或未見報道。本研究從甘藍型油菜中克隆了BnNPR1，并系統地研究了其在各種防衛信號分子和環境因子脅迫下的表達響應，結果顯示，BnNPR1是SA和JA以及低溫、重金屬、干旱、高鹽等各種環境脅迫及激素脅迫因子的響應基因。

迄今為止，多種植物的NPR1同源基因已被克隆，并且展開了這個基因的植物抗逆功能的研究。在擬南芥(Arabidopsis)中，AtNPR1參與增強由SA介導的flg22誘導的MPK3和MPK6的激活[21]，本研究SA處理條件下，BnNPR1的表達量極顯著升高，特別是在6 h時表達量上調到未處理時的近20倍，表明NPR1在SA途徑中發揮重要作用；在煙草(Nicotianaattenuata)中，其NPR1通過影響早期酶的合成途徑參與JA生物合成的誘導[22]，本調查結果也發現在JA的處理下，BnNPR1的表達量響應顯著，說明NPR1可能在油菜中也參與JA信號途徑。這些研究結果共同指出NPR1在SA和JA等防衛信號途徑中起作用。

當植物受到外界環境脅迫時，其生物脅迫與非生物脅迫中的防衛反應信號調控機制是復雜的。Jayakannan等在擬南芥中發現，依賴于水楊酸途徑的NPR1缺失突變體在鹽脅迫下表現為敏感的，表明NPR1依賴的SA信號途徑對鹽是非常重要的[10]。Liu等在擬南芥中發現ET/SA雙突變體比ET敏感單突變體(ein2)和SA敏感單突變體(npr1)對低溫處理更加敏感，表明除了SA途徑，ET信號途徑也在低溫脅迫中起作用[12]。本研究對甘藍型油菜的調查結果顯示，BnNPR1是鹽和低溫脅迫的響應因子。另外，本研究首次發現BnNPR1也是重金屬環境脅迫的響應基因。本研究的數據將為進一步研究BnNPR1在油菜抗逆中的功能及其機制提供線索。