30種半翅目昆蟲線粒體COⅠ基因密碼子偏好性聚類分析

張玉波，周中艷，王廷慧，鄧 娟

(1.安順學院農學院，貴州安順 561000； 2.貴州省昆蟲信息系統與資源開發利用重點實驗室，貴州安順 561000)

COⅠ基因包含豐富的遺傳信息，既相對保守又能保證足夠變異，可作為屬種系統進化研究的良好標記，被認為是動物界中最適合的DNA條形碼標準基因[1-2]，目前已被廣泛應用于昆蟲分子系統發育分析。密碼子偏好性指在編碼氨基酸合成蛋白時，往往優先使用某一種或幾種密碼子[3]，被優先選用的密碼子稱為最優密碼子，這一現象廣泛存在于絕大部分的生物類群中[4]。Lynn等研究認為，不同的物種對密碼子的使用具有很強的特異性，在進化過程中相近的物種具有相似的密碼子使用模式，說明物種的密碼子使用特點在進化過程中具有保守性，這種變化直接反映在核苷酸的組成上[5]。宋喬喬等對17種動物進行研究得出，密碼子偏好性與物種之間的親緣關系有關，親緣關系越近的差異越小[6]。張曉峰等對水稻和擬南芥NBS-LRR基因家族同義密碼子使用偏好的研究得出，NBS-LRR基因家族的密碼子使用偏好受物種自身的影響很大[7]。晁岳恩等對11種植物psbA基因進行密碼子偏好性分析，認為密碼子偏好性不能正確反映物種間的進化關系[8]。

頭喙亞目(Auchenorrhyncha)屬于昆蟲綱(Insect)半翅目(Hemiptera)，活潑善跳，飛翔能力強，刺吸式口器，在吸取植物汁液后傳染病毒，是重要的農林害蟲。目前，該亞目的4個總科分類系統被昆蟲分類學者廣泛接受，即蠟蟬總科(Fulgoroidea)、蟬總科(Cicadoidea)、沫蟬總科(Cercopoidea)、葉蟬總科(Cicadelloidea)[包括角蟬科(Membracidae)及其近緣科]。近年來研究表明，蠟蟬總科、沫蟬總科、角蟬總科(包括傳統的葉蟬總科)、蟬總科均為單系群[9]。Campbell等多位學者就頭喙亞目是否為一單系群進行了研究，總體上認為蠟蟬次目與異翅亞目的親緣關系較近或為姐妹群[10-12]，線粒體基因組數據的研究同樣支持頭喙亞目為并系，但也認為鞘喙亞目與蠟蟬次目為姐妹群關系[13-15]。

本研究基于半翅目(Hemiptera)30種昆蟲線粒體COⅠ基因密碼子偏好性，利用SPSS 19.0對其密碼子偏好性進行系統聚類分析，探究頭喙亞目中各類群之間的關系及密碼子偏好性在該類群的系統發育分析中的可信度。

1 材料與方法

1.1 序列數據

從GenBank中選擇線粒體全基因組測序完整的30種昆蟲，其中頭喙亞目下蠟蟬總科有9種昆蟲、沫蟬總科有5種昆蟲、葉蟬總科有10種昆蟲、蟬總科有3種昆蟲，鞘喙亞目(Coleorrhyncha)鞘喙蝽總科(Karabasiidae)有3種昆蟲。獲得其中COⅠ基因全長編碼區序列(coding sequence，簡稱CDS)部分，全基因組登錄號見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1COⅠ基因中G、C含量分析 采用CodonW 1.4.2對30種昆蟲COⅠ基因序列密碼子進行分析，統計分析基因密碼子的堿基組成規律，測得鳥嘌呤和胞嘧啶總體(G+C)含量、密碼子第3位堿基(A3、G3、C3、T3)組成、密碼子第3位的 C+G 數量(GC3)等數據。

1.2.2 有效密碼子數量(effective number of codons，簡稱ENC)及同義密碼子使用度(relatively synonymous codon usage，簡稱RSCU)分析 參照Fuglsang的方法[16]，利用有效密碼子數來衡量基因單個密碼子使用頻率的偏好程度，其值在 20～61之間，越接近20偏好性越強[17]。同義密碼子相對使用度是指對于某一特定的密碼子在編碼對應氨基酸的同義密碼子間的相對概率。采用同義密碼子相對使用度作為衡量COⅠ基因密碼子使用偏好性的指標，RSCU越高，表示該密碼子的相對使用率越高，它去除了氨基酸組成對密碼子使用的影響參考，直觀地反映了密碼子使用的偏好性[18]。

表1 線粒體全基因組序列登錄號

1.2.3 RSCU聚類分析 參照劉漢梅等利用SPSS 19.0對30種半翅目昆蟲線粒體COⅠ基因RSCU進行聚類分析[19-20]。

2 結果與分析

2.1 COⅠ基因的密碼子偏好性

各種類COⅠ基因的有效密碼子數及密碼子第3位的堿基含量見表2。分析COⅠ基因的堿基組成發現，30種昆蟲中G+C含量在28.1%～36.4%之間，A、T含量明顯高于G、C。密碼子也以A或T結尾較多，A、T含量分別在34.65%～72.68%、28.27%～57.23%之間。30種昆蟲密碼子第3位4種堿基T、C、A、G占比平均值分別為40.66%、13.96%、58.04%、5.97%。這與Clary等指出的昆蟲線粒體基因組具有比較高的A、T堿基含量，密碼子的第3位傾向于選擇A或T的結果[21-22]相符。

30種昆蟲COⅠ基因的ENC在30.95～48.53之間，平均值為37.25，總體上看本研究所選用的類群基因密碼子具有較強的偏好性。沫蟬總科、蟬總科、葉蟬總、蠟蟬總科、鞘喙蝽總科等代表物種的ENC平均值分別為31.88、34.22、35.92、39.98、45.44。其中，相對古老的類群如蠟蟬總科、鞘喙蝽總科的ENC明顯較高，說明其COⅠ基因密碼子偏好性較弱，較為進化的類群如沫蟬總科(Cercopoidea)、蟬總科(Cicadoidea)的COⅠ基因密碼子偏好性較強。梁愛萍通過對多位學者的研究總結提出，半翅目中親緣關系為胸喙亞目+{蟬子亞目+[蠟蟬子亞目+(鞘喙亞目+異翅亞目)]}[9]；Wang等通過對頭喙亞目線粒體全基因組的分析得出，頭喙亞目內的親緣關系為蠟蟬總科+[葉蟬總科+(沫蟬總科+蟬總科)][23-24]。通過前后對比發現，同一單系群中親緣關系越近的類群其COⅠ基因有效密碼子數量差別越小，且在進化中越古老的類群COⅠ基因密碼子偏好性越弱，這可能與線粒體COⅠ基因具有較高的進化速率有一定的關系。

2.2 COⅠ基因CDS聚類分析

以每一條基因代表作為對象，將該基因的RSCU作為變量，根據基因中各密碼子RSCU，利用SPSS 19.0進行聚類分析。

由圖1可知，褐飛虱屬(Nilaparvata)中3個物種及禾沫蟬屬(Callitettix)中3個物種分別完美地聚在了一起，沫蟬總科5個、葉蟬總科10個、蟬總科3個物種均較好地聚在一起，說明基于COⅠ基因密碼子偏好性的聚類分析可以在一定程度上反映物種之間的親緣關系。蠟蟬總科中的斑衣蠟蟬(Lycormadelicatula)與八點廣翅蠟蟬(Ricaniaspeculum)聚在了沫蟬總科里，蠟蟬總科內種類也聚成了2支，且聚類混亂。這些不正確的聚類估計與蠟蟬總科的COⅠ基因密碼子偏好性較弱有一定的關系。鞘喙蝽總科2種昆蟲同絕大部分的蠟蟬總科聚在了一起，這與Song等通過線粒體基因組數據對比支持鞘喙亞目與蠟蟬次目親緣關系較近的結果[13-15]較為一致。

表2 COⅠ基因密碼子偏好性及密碼子第3位堿基的構成

注：3s表示密碼子第3位堿基的構成。

3 討論

通過以上研究發現，基于30種昆蟲COⅠ基因密碼子偏好性的聚類分析在一定程度上可以反映物種間的親緣關系，但也有一定的局限性，如蠟蟬總科下的昆蟲類群聚類結果較為混亂，可能在同一單系群中COⅠ基因密碼子偏好性的聚類分析更適用于較為進化的類群。雖然本研究結果表明，同一單系群中越古老的類群其COⅠ基因密碼子偏好性相對越弱，但考慮COⅠ基因的長度較小，選用的物種數量有限等問題，這一結果尚須要更多的數據來證實。研究中選用的2屬6種昆蟲極好地聚成了2個分支，而較高級分類階元之間聚類稍顯混亂，也顯示出基于COⅠ基因的昆蟲密碼子偏好性聚類分析更適于低級階元親緣關系的研究，這可能與COⅠ基因的長度小、進化較快有一定的關系。