選擇性激光熔化成型技術制備Ti6Al4V 對骨髓間充質干細胞生物學行為的影響*

劉才輝 鄢榮曾 熊花平 萬 娜 高 琪 何肖霞

鈦及其合金材料現已被廣泛應用于臨床醫(yī)學中，主要作為植入性材料用于人體的骨骼、組織、器官中。然而，在一系列的臨床醫(yī)學應用中逐漸發(fā)現，由于鈦及其合金受其自身力學特性的影響，在其受力過程中會發(fā)生“應力屏蔽”現象，鈦及其合金的彈性模量雖然較低，但仍高于人體的骨組織，因此容易造成植體的松動脫落[1]。針對這一問題，有學者提出以孔隙結構來改善鈦及其合金的彈性模量，通過調節(jié)孔隙率達到與自然骨相近的力學性能，從而減弱或消除應力屏蔽的作用[2]。但目前的傳統工藝成型技術難以滿足植體的要求。選擇性激光熔化技術(selective laser melting，SLM)是快速成型技術的最新發(fā)展形式之一，它利用計算機建立所需的CAD模型，設計出功能型結構，利用專業(yè)軟件將模型轉換成分層文件，導入3D打印成型設備，可以直接將金屬粉末成型，并不受外型限制，制作出任何形態(tài)的植體。在口腔領域中，可以利用此技術對醫(yī)用Ti6Al4V合金粉末進行熔融燒結，從而獲得利于骨結合的粗糙表面，制作出牙冠內冠基臺或植入體等個性化部件。同時，還可對鈦合金植入體與骨接觸的界面進行多孔化處理，以期血管及成骨細胞長入多孔結構內，促進植入體與骨的牢固結合，從而延長植入體的使用壽命。本文采用SLM成型技術制作Ti6Al4V試件，對其細胞毒性、細胞存活率、細胞凋亡率等方面進行生物學行為的綜合評價。

1.材料與方法

1.1 試件的制備、分組及處理 采用SLM技術對Ti6Al4V粉末及純鈦粉末進行加工，分別制成直徑15.5mm，厚度1mm的圓形Ti6Al4V試件和純鈦試件。將所有試件放入含丙酮的無水乙醇中超聲清洗30min，分別在800目、1500目、2000目的砂紙上進行機械打磨，將其表面的氧化層、污垢層打磨干凈后，依次放入100%丙酮中及100%乙醇中超聲清洗30min，干燥消毒儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞毒性實驗

1.2.1 比格犬骨髓間充質干細胞的培養(yǎng) SPF級比格犬在3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉下，行髂骨的骨髓穿刺，抽取骨髓組織10ml，離心15min，棄去上層脂肪及上清液后，將骨髓間充質干細胞進行重懸。將細胞懸液沿離心管壁緩慢加入含有Percoll細胞分離液的離心管中，離心25min，吸取離心后中間層呈云霧狀的單核細胞層，加入放有培養(yǎng)液的離心管內，離心10min，棄去上清液，加入培養(yǎng)液3ml，后置于CO2孵箱內培養(yǎng)。待細胞增殖至培養(yǎng)瓶底65%-85%時，進行傳代，以第3代或第4代細胞用于后續(xù)實驗及胚胎來源鑒定。

1.2.2 骨髓間充質干細胞的鑒定 對骨髓間充質干細胞的成骨誘導，取第4代生長狀態(tài)良好的骨髓間充質干細胞，加入成骨誘導劑(1.0×10-8mol/L地塞米松、60μg/mL維生素 C、6mmol/L β-甘油磷酸鈉、含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)，每3-4d更換誘導劑一次。于第21d終止培養(yǎng)，棄去器皿內液體，PBS反復并緩慢沖洗3遍。4%多聚甲醛常溫下固定30min后PBS反復沖洗3遍，滴入茜素紅染料，于37℃培養(yǎng)箱中15min后，吸去茜素紅染料，PBS漂洗，拍照。

1.2.3 細胞相對增殖率及細胞毒性分級 將經過無菌處理的Ti6Al4V試件和純鈦試件置于24孔板底，取第3代骨髓間充質干細胞，調整細胞濃度至3×104/ml，制成細胞懸液，以每孔1ml從試件的上表面滴加懸液，接種于24孔板中。分為Ti6Al4V試件組、純鈦試件組，以含100ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液為空白對照組，每組8個復孔。細胞培養(yǎng)72h后，棄去原培養(yǎng)液，加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3h后，以酶聯免疫吸附儀在450nm波長下測量溶液吸光度值，計算各組試件的細胞相對增殖率(RGR)，公式為RGR=實驗組A值/空白對照組A值×100%。根據細胞相對增殖率，確定細胞毒性分級[3]：0級為RGR≥100%，1級為75%＜RGR＜99%，2級為50%＜RGR＜74%，3級為25%＜RGR＜49%，4級為1%＜RGR＜24%。

1.2.4 細胞存活率的檢測[4，5]將Ti6Al4V試件和純鈦試件置于24孔板底，取第3代骨髓間充質干細胞，調整細胞濃度至3×104/ml，制成細胞懸液，以每孔1ml從試件的上表面滴加懸液，接種于24孔板中。將放有Ti6Al4V試件和純鈦試件的孔板設為實驗組，陰性對照組為加入100ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組8個復孔。復合培養(yǎng)72h后，以0.25%胰酶對試件上的細胞進行消化，將細胞置于離心管內離心，調整細胞濃度至1×106/ml。用4%濃度的Trypan Blue母液以0.01mol/l的PBS稀釋至0.4%，45μl細胞懸液與5μl 0.4%Trypan Blue 混合后，37℃靜置 3min，于已消毒的細胞計數板蓋玻片的一側加入細胞懸液，至溢滿計數板，但不能過多。用10×物鏡觀察計數板四角大方格和中間方格的活細胞及死細胞數，以計上不計下、計左不計右原則，Trypan Blue會將壞死細胞染成藍色。計數各組存活細胞以及總細胞并計算各組的細胞存活率。另取24孔板，將Ti6Al4V試件和純鈦試件置于24孔板底，取第3代骨髓間充質干細胞，調整細胞濃度至3×104/ml，制成細胞懸液，以每孔1ml從試件的上表面滴加懸液，接種于24孔板中。復合培養(yǎng)72h后，以0.25%胰酶對試件上的細胞進行消化，將細胞置于離心管內離心，調整細胞濃度至1×106/ml接種于6孔板中，接種24小時后棄去原培養(yǎng)液，PBS沖洗兩次后，加入多聚甲醛固定15min后棄去，PBS沖洗兩次，加入DAPI 1ml/孔，室溫下避光10min后，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 細胞凋亡檢測——Annexin V/PI雙染色法 將Ti6Al4V試件和純鈦試件置于24孔板底，取第4代生長狀態(tài)良好的骨髓間充質干細胞，經胰酶消化后，應用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細胞濃度調整至5×105/ml，以每孔1ml從各試件的上表面滴加懸液，接種于24孔板中，每組設有8個復孔。將其置入CO2孵箱內共培養(yǎng)48h后，收集所有細胞，將細胞濃度調整為1×106/ml，以PBS離心2000rpm，5min，洗滌2次，加入500μL的Annexin V Bingding Buffer懸浮細胞，再加入5μL的Annexin V-FITC混勻后，加入5μL Propidiumlodide混勻、避光下，染色30min，應用流式細胞儀以激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長530nm檢測各組的細胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率。

1.3 統計方法 應用SPSS 22.0統計軟件對數據進行分析，計數資料以均數±標準差表示，計量資料以率表示，組間比較采用單因素三水平方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)及鑒定 骨髓間充質干細胞培養(yǎng)7d后，倒置顯微鏡下可見細胞呈梭形生長，分布均勻，3-4d即可融合，形態(tài)亦趨于一致，呈束狀排列。對骨髓間充質干細胞施與成骨性誘導21d，經茜素紅染色，可觀察到有鈣化結節(jié)形成，說明培育所得細胞具有形成骨的分化潛質(見圖 1，圖 2)。

圖1 細胞傳代后生長良好(×400 倍)

圖2 細胞經茜素紅染色，可觀察到有鈣化結節(jié)形成(×200 倍)

2.2 兩組細胞毒性的比較 經過72h的復合培養(yǎng)，各組細胞增殖情況見表1。細胞相對增殖率Ti6Al4V試件組與空白對照組相比，無統計學差異(P＞0.05)，純鈦試件組與空白對照組相比，無統計學差異(P＞0.05)。且Ti6Al4V試件組與純鈦試件組之間細胞相對增殖率不存在統計學差異(P＞0.05)。兩組的毒性分級均為1級，表明兩種材料均無細胞毒性。

表1 兩組細胞的相對增殖率及毒性分級(n=8,x±s，%)

兩組細胞經過72h的復合培養(yǎng)，兩組的細胞存活率都大于90%，盡管略低于對照組DMEM組，但Ti6Al4V試件組、純鈦試件組與DMEM組間無統計學差異(P＞0.05)，且實驗組兩組之間也無統計學差異(P＞0.05)，見表2，圖3。

表2 Trypan Blue染色計算各組細胞存活率(n=8,x±s，%)

圖3 各組細胞經Trypan Blue染色

2.3 各組材料對犬骨髓間充質干細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測了各組材料對犬骨髓間充質干細胞凋亡的影響。結果發(fā)現，各組材料與犬骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)48h后，早期細胞凋亡率、晚期細胞凋亡率及總凋亡率Ti6Al4V試件組、純鈦試件組均高于DMEM組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，但Ti6Al4V試件組與純鈦試件組之間無統計學差異(P＞0.05)，見表3。

表3 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細胞凋亡率的影響(n=8,%)

3.討論

骨結合于20世紀60年代提出，它是指體內植體與骨相結合，是植體植入穩(wěn)定的前提條件。骨結合受材料生物相容性、材料結構、材料表征等多方面的影響，其中，影響植體穩(wěn)定性的主要因素便是材料的結構及材料的表征，同時，材料還應對細胞的粘附、增殖、細胞表型的表達有促進作用[6，7]。含鈦材料為目前應用較廣泛的生物材料之一，它具有質量輕、強度高等優(yōu)良的物理特性。鈦及鈦合金現已被廣泛應用到醫(yī)學領域中，特別是在骨科疾病及口腔科領域中。

有研究表明，多孔材料有利于骨組織的長入，促進骨組織與多孔材料的連接，而且其多孔結構還可以影響細胞的增殖、分化、粘附及生長，有利于進一步的誘導成骨，此外，多孔結構增加的接觸面積可以改變表型的表達，促進更多的成骨細胞分化[8，9]，以往多孔成型的方法主要為空間支撐技術、冷鑄法、激光成型等方法。這些方法都存在一定的限制性，空間支撐法、冷鑄法成孔較隨機，激光成型法可控制一定的孔的分布、形態(tài)及大小[10]。但這些方法所制得的制件其機械性能與骨組織有較大差異，且其形態(tài)自由度受到很大限制，對于形狀復雜的零件，不容易復制。3D打印技術，是快速成型技術的一種，它是在數字模型的基礎上，通過計算機軟件中的分層離散和數控成型技術，以激光束、電子束的形式將粉末狀的金屬或塑料粘合，逐層堆積[11]。目前，3D打印技術中比較成熟的分支主要有SLM技術、EBM電子束熔融(Electron Beaming Melting)等，其中SLM技術也是現今的研究熱點。通過SLM激光燒結技術所制得的成品的強度要高于其他3D打印技術，它的加工速度很快，不需要支撐材料，材料的適用面廣，精度高，可獲得較高的形態(tài)自由度，基本可以制作出任意形狀的制件，現已逐漸發(fā)展成為制作孔結構制件的較好選擇之一[12]。但其也存在缺點，比如高溫會破壞生物材料中的化學成分，粉末燒結出的表面略粗糙，不能打印細胞、生長因子等成分[13]。近些年來，研究者關于SLM成型制件對改善鈦材料的生物相容性做了一定的研究。T.Habijan C.等研究證實，SLM成型技術存在制作鈦鎳合金多孔支架材料的可行性[14]。Johan，Blokhuis等應用SLM成型TC4材料制作特定尺寸下的制件，通過制得不同尺寸的鈦合金支架，比較不同尺寸孔徑下的成骨能力，結果證實多孔支架的成骨能力明顯高于無孔支架的成骨能力，同時證實，孔徑在150-500μm時，成骨能力最強[15，16]。作者經前期實驗制得的Ti6Al4V合金材料的孔徑約350μm左右，孔隙率約45%，基本符合Johan等人研究的材料成骨能力最強的范圍。因此，本實驗將此方法制得的Ti6Al4V合金材料與純鈦材料相比較，研究了骨髓間充質干細胞在兩種材料上的生物學行為。

細胞粘附在含鈦材料表面分為以下幾個過程：血清蛋白吸附于鈦材料的基底；細胞與鈦材料的基底相連；細胞向鈦材料中延伸[17]。對細胞毒性分級從大至小依次為：Ag+＞Au3+＞Cu2+＞Co2+＞Pd2+＞Cr3+＞In3+＞Sn2+[18]。本實驗的體外細胞毒性實驗結果觀察到，骨髓間充質干細胞與Ti6Al4V合金及純鈦共培養(yǎng)72h后，細胞生長狀態(tài)良好，表明兩種材料對細胞的活力沒有影響，不會對細胞的代謝或功能造成影響。本研究還發(fā)現，Ti6Al4V合金與純鈦的毒性等級均為1級，且純鈦及Ti6Al4V合金上骨髓間充質干細胞的細胞相對增殖率與空白對照組相比無統計學差異，說明兩種材料均不會對組織及生物系統產生毒副作用或不良反應，且具有一定的抗炎作用，因此提高了其生物相容性。有研究報道，與Ti6Al4V合金相關的離子在體外會抑制骨髓基質細胞與成熟成骨細胞的正常分化[19]。但本實驗研究結果顯示，Ti6Al4V合金與純鈦上骨髓間充質干細胞生長狀態(tài)均較良好，72h的細胞存活率兩者間無明顯差異。如果能夠進一步提高Ti6Al4V合金的穩(wěn)定程度，抑制離子的釋放，將更有利于該合金的臨床推廣及應用。

細胞凋亡是一個極其復雜，且受多種基因影響的細胞死亡過程，它大致可以分為三個階段：起始階段、效應階段、清除階段。它屬于可導致細胞發(fā)生解體的一系列分子級聯反應，它需要將凋亡受體激活，將凋亡誘導因子活化，從而引起線粒體發(fā)生變化，當核酸內切酶被激活時，細胞即表現出凋亡特征，直至形成凋亡小體[20]。有研究人員表明，計算細胞總RNA量并結合細胞毒性實驗、分子生物學實驗等可以作為綜合評價材料生物相容性的一個參考[21]。本實驗中，將骨髓間充質干細胞與Ti6Al4V合金及純鈦合金共培養(yǎng)，48h后檢測兩組材料對細胞凋亡的影響，發(fā)現Ti6Al4V與純鈦的早期細胞凋亡率、晚期細胞凋亡率及總凋亡率之間無統計學差異，但均高于DMEM組，說明Ti6Al4V與純鈦對細胞的凋亡均存在一定的影響，但兩者之間對細胞凋亡的影響差異不大。

本文通過對Ti6Al4V合金與純鈦的體外生物學行為的研究，提示兩種鈦材料對細胞均無細胞毒性，無明顯刺激性。均表現了較好的細胞存活率，兩種材料間未見對細胞凋亡的差異，相容性良好。