病原微生物檢測技術研究進展

徐夢嬌 高姍姍 肖堯

【摘 要】對于病原微生物的檢測技術主要有常規檢測、免疫學檢測以及基因檢測等，但由于各種檢測方法均有其優缺點、檢測范圍以及使用領域，因此，為適應現代社會對檢測病原微生物的要求，必須加強對病原微生物檢測技術的研究、創新，在實際工作中，依據檢測設備技術條件，綜合考量各自檢測方法，以選取檢測效果較好的方法。文章主要對各種病原微生物檢測技術進行分析。

【關鍵詞】病原微生物；檢測技術；研究進展

病原微生物主要指對人和動物存在致病性的各類微生物，包括細菌、病毒、真菌、放線菌、螺旋體、朊粒、立克次體、支原體、衣原體等。病原微生物會影響食品以及水源的安全，人和動物感染病原微生物以后，會出現過敏反應或者癡呆、腫瘤等多種疾病。隨著現代檢驗技術的不斷發展，病原微生物檢測技術也得到了發展，從常規檢測發展到免疫學檢測技術、基因檢測技術等，并廣泛用于醫療、疾控、食品安全檢驗等方面。

一、病原微生物常規檢測方法

（一）涂片鏡檢法

在染色和形態上具有明顯特征的病原微生物適合使用涂片鏡檢法進行檢測。例如，白喉棒狀桿菌、葡萄球菌或結核分枝桿菌等引起感染性疾病的病原微生物，經過適當處理，將標本置于顯微鏡下檢測，分別呈現有異染顆粒的棒狀桿菌、革蘭陽性葡萄串狀球菌以及抗酸性細長桿菌等；對于糞便中的霍亂弧菌和志賀菌等，也可通過涂片鏡檢法，在熒光顯微鏡下進行快速檢測。應用涂片鏡檢法進行病原微生物檢測時，只需要革蘭染色液和普通光學顯微鏡，是各類微生物檢測實驗室的常用檢測方法。

（二）組織細胞培養檢測法及生物化學試驗

組織細胞培養檢測法適用于組織細胞內生存的病原體，例如病毒、立克次體以及衣原體等。由于不同的病原體其組織敏感細胞也有差異，因此，可以從病原體敏感的動物組織中，提取活細胞于體外實施原代培養，或者實施傳代培養，并將病原體接種到相應的組織細胞內，使病原體在細胞中進行繁殖增長，從而使特異性的細胞產生病變反應；還可以通過直接在敏感動物體內接種病原體，使相應的組織器官出現特異性的病理變化，從而根據出現的特異性病變鑒定病原體。一般情況下，多數病原體在培養16～20小時后均可以得到理想的菌落，但也有少量病原菌需要經過數月的培養，才能形成一定數量的菌落，但在實際工作時，檢測人員往往需要快速、準確的知曉病原微生物種類，隨著各種全自動微生物及藥敏系統的研發以及廣泛應用，能夠有效緩解這一情況。

二、免疫學檢測方法

（一）免疫熒光技術

免疫熒光技術（Immunofluorescence techⅡique），也就是通常所說的熒光抗體技術，主要內容是在該抗原或抗體上加入含有熒光的物質，需要保證該熒光物質不會影響機體的特性，通過顯微鏡進行觀察，找到有熒光標記的抗原或抗體，從而實現監督和鑒別的功能。具體方法是：第一，抗體或者抗原從待檢樣本中分離出來，使抗體或抗原與固相載體發生反應；第二，將抗原或者抗體以洗滌的方式從固相載體中分離出來，讓固相載體以一定的比例跟待檢樣本混合，并添加一些酶與其發生反應，從而產生易于辨別的有色物質，根據有色物質的深淺，就能夠分析和判定待測樣本中的微生物種類及狀況等。該檢測方式的優點是耗費時間較短、靈敏度較高。

（二）酶聯免疫法

酶聯免疫法應用范圍較廣，是一種固相免疫測定技術。該檢測方法的內容是：在固原載體的表面吸附已知抗原或者抗體，保證其原本的免疫活性；在檢測過程中，使待檢測樣本與表面吸附抗體或抗原的固相載體發生反應，然后加入酶標抗體，進行免疫復合物結合操作，采用洗滌方法，將抗原或者抗體復合物與游離的未結合成分進行分離；最后再加入酶反應底物，通過觀察被酶催化后的底物所產生的顏色以及吸光度值大小，從而測定病原微生物種類。該檢測方法具有方便快捷、特異性強、靈敏度高、易于標準化管理的優點，被廣泛應用于多細菌檢測工作中。

三、基因檢測方法

（一）聚合酶鏈反應技術

聚合酶鏈反應技術（Polymerase Chain Reaction，PCR）是新型的基因檢測方法。該技術主要是根據目的基因，設計一對特異寡核苷酸引物，在反應體系中加入4種dNTP和DNA聚合酶，以目的基因作為模板，進行DNA體外擴增的技術，由于反應可以進行多次循環，因此可以在短時間內擴增，以獲得大量目的基因。PCR及其衍生的多種方法已廣泛用于病原微生物的檢測。例如病原性大腸桿菌O157：H7的檢測，可使用實時熒光定量PCR或者隨機擴增多態性（RAPD）DNA標記等方法。張洪軍等利用PCR-DGGE與熒光原位雜交技術（FISH）技術，分析了生活污水中的硝化菌群；Yolanda等采用PCR和FISH，快速檢測出彎曲桿菌。

PCR檢測方法應范圍很廣，但由于DNA檢測無法區分死、活細胞，從而無法準確判斷微生物是否具有感染力。另外，PCR檢測法反應靈敏，任何污染都會造成假陽性結果，任何抑制劑都會抑制PCR反應，因此，其穩定性較差，容易產生非特異性產物。

（二）DNA芯片檢測技術

DNA芯片，也稱為DNA微陣列，DNA芯片檢測技術可在同一時間對大量樣品進行高通量分析，芯片的類型可分為固定寡核苷酸探針和PCR擴展子兩類。其主要內容是利用機械系統，將DNA探針陣列分布于硅基片或玻璃上，從而形成100～200μm的多個點，保證點間間距為200～500μm，每個點含單鏈的寡核苷酸片段，與待測組分進行雜交，通過檢測熒光或其他標記物，進而檢測病原微生物。檢測流程如圖1所示。

DNA芯片檢測法使用特異DNA，檢測速度快，可同時檢測多種不同的病原微生物，可避免傳統方法漫長等待影響檢測結果，但DNA芯片法不適用于DNA濃度低時，PCR將會增加樣本中DNA濃度，通過DNA芯片檢測與PCR擴增結合，可以提高檢測的靈敏度，更易于檢測。相對于傳統的培養方法，此方法更加快捷，可以對多種微生物同時進行檢測，極大的加快檢測速度，盡快得到檢測結果。

四、結束語

隨著我國社會的不斷發展，各種病原微生物造成的問題層出不窮，這就對病原微生物檢測技術提出了更高的要求。當前的病原微生物檢測技術主要有常規檢測技術，免疫學檢測技術以及基因檢測技術等，在操作簡便，檢測時不需要較多樣本，節省時間，且不會出現污染，能夠保證檢測結果的準確性，但不論哪種檢測方法都有其局限性，因此，在實際工作中，要根據病原微生物的特點，結合使用不同的檢測方法，從而在病原微生物的檢測方面發揮更加重要的作用。

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