豬瘟、藍耳、圓環、偽狂犬病毒PCR快速診斷方法的建立

楊 科 丁 宏 羅祥波 普仕華 郭兆衛 侯明省 馮德正 張書光*

（1.德宏州動物疫病預防控制中心，云南芒市 678400;2.梁河縣動物疫病預防控制中心，云南梁河 679200;3.隴川縣動物疫病預防控制中心，云南隴川 678700）

隨著養豬業規模化和集約化方向發展，豬群常發生多病原混合感染、繼發感染，其中豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬藍耳病毒（PRRS）是較易混合感染的危害養豬業的四大病毒性疫病。近年來這四種病毒病溫和型不斷出現，通過臨床癥狀、病理解剖和藥物診斷往往無法做出準確的診斷，常常需要借助實驗室檢測才能做出確診，而實驗室檢測需要組織處理、核酸提取、PCR擴增和電泳檢測四大流程，四種病毒病檢測下來最快需要兩到三天甚至更久，使得養殖戶蒙受巨大損失，因此如何在不影響靈敏度和準確度的前提下縮短檢測流程已迫在眉睫。我們獸醫實驗室經過大量摸索，樣品處理、核酸提取流程均已優化，可在半個小時內提取到總核酸，在此基礎上建立起了一種單臺PCR、單次PCR擴增、一次性檢測豬瘟、藍耳、圓環、偽狂犬病毒四種病原的方法。

1 材料與方法

1.1 陽性病料和引物設計、合成

陽性病料和豬瘟、藍耳、圓環、偽狂犬病毒檢測引物由云南省動物疫病預防控制中心提供。引物擴增片段大小為350bp。

1.2 儀器設備、酶和試劑盒

核酸自動提取儀NP968-S（西安天隆），震動球磨儀GT200（格瑞德曼），PCR儀（德國耶拿），Syngene凝膠成像系統（美國UVP），Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒（西安天隆），PrimeScript? One Step RT-PCR Kit（TAKARA）。

1.3 總RNA的提取

分別應用西安天隆科技有限公司生產的Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒和從陽性病料（脾、肺、淋巴結）中提取總DNA/RNA，具體操作過程見說明書。

1.4 四種病毒快速診斷方法的建立

根據實驗室前期的大量摸索，豬瘟、藍耳、圓環、偽狂犬引物的最佳退火溫度分別為54℃、50℃、55℃、58℃，利用梯度PCR的touchdown功能（在引物退火溫度摸索過程中，每一列的溫度都不相同，將四種引物的最高和最低TM值作為區間），將四種檢測不同病毒核酸的體系放置于一臺PCR中進行擴增，一次擴增相當于利用四臺PCR同時擴增，大大縮減PCR所需時間。

2 結果

2.1 總RNA提取效果圖

使用核酸自動提取儀提取法（磁珠法）提取陽性病料中的總核酸，電泳檢測發現提取出了高質量的RNA，符合本實驗要求。

疫苗總RNA提取效果圖

2.2 四種病毒快速診斷方法的建立

3 討論

隨著養豬業規模化和集約化方向發展，豬群常發生多病原混合感染、繼發感染，其中豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬藍耳病毒（PRRS）是較易混合感染的危害養豬業的四大病毒性疫病。近年來這四種病毒病溫和型不斷出現，通過臨床癥狀、病理解剖和藥物診斷往往無法做出準確的診斷，常常需要借助實驗室檢測才能做出確診，而實驗室檢測需要組織處理、核酸提取、PCR擴增和電泳檢測四大流程，四種病毒病檢測下來最快需要兩到三天甚至更久，使得養殖戶蒙受巨大損失。因此，我們建立了一種可快速準確一步法檢測四種豬病的RT-PCR 技術。

目前RT-PCR檢測豬病的技術主要環節為樣品處理、核酸提取和穩定的檢測引物三個方面。本實驗將四種豬病的檢測流程簡化為一次PCR擴增，本來需要三天才能完成的檢測一天完成，大大縮減養殖戶等待檢測結果的時間，可以更好地為養殖戶提供診斷和治療建議。

試驗結果表明，一步法檢測四種豬病的RT-PCR 技術和單獨擴增方法并無區別，只是利用PCR儀的touchdown功能，將本該四次PCR擴增的步驟簡化為一步完成，大大縮減檢測時間，提高了監測效率，可以廣泛推廣使用。