不同低氧對(duì)大鼠肺、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響

摘要：目的 研究不同低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs ）、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（AASMCs ）增殖的影響。方法 將原代培養(yǎng)的大鼠肺、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分為對(duì)照組常氧（21% O2，74% N2，5% CO2 ）、實(shí)驗(yàn)組低氧（15%O2 ，85% N2，5% CO2） ；（10% O2，85% N2，5% CO2） ；（5% O2，90% N2，5% CO2） ；（3% O2，92% N2，5% CO2），培養(yǎng)48h后通過細(xì)胞胞計(jì)數(shù)和WST-1法測(cè)定肺、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖并分析差異性。結(jié)果 表明PASMCs 在各個(gè)低氧濃度下均能發(fā)生增殖反應(yīng)，而在10% O2、5% O2、3% O2條件下與對(duì)照相比具有呈著性差異（P<0.01）；（AASMCs ）在3% O2條件下可發(fā)生增殖反應(yīng)且與對(duì)照相比呈著性差異（P<0.01）。結(jié)論 大鼠PASMCs和AASMCs對(duì)不同低氧濃度的敏感度不同。

關(guān)鍵詞：主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 低氧 增殖

低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）是高原低氧及慢性阻塞性肺疾患發(fā)展成為肺源性心臟病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HPH在高原地區(qū)較常見，但是很少發(fā)生低氧性主動(dòng)脈，造成這樣現(xiàn)象的機(jī)制目前還不清楚。HPH的主要病理變化以肺動(dòng)脈收縮反應(yīng)增強(qiáng)及肺血管結(jié)構(gòu)重建為主要特征。血管的重構(gòu)主要是動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（ASMCs）的增殖，ASMCs增殖主要受血管外周微環(huán)境的影響，即肺泡氧分壓。高壓人體呈健康狀態(tài)時(shí)，肺血管所處的周圍肺組織中氧分壓是105 mmHg，而體循環(huán)血管所處的周圍組織器官氧分壓一般低于40 mmHg。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在從細(xì)胞水平探討不同低氧對(duì)大鼠PASMCs、AASMCs增殖的影響。

一、材料與方法

（一） 材料

雄性 200 g SD 大鼠，由空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物室提供；胎牛血清（Hyclone），非必需氨基酸（Hyclone），DMEM高糖培養(yǎng)液（Hyclone），胰酶（Hyclone），wst-1 （碧云天）、其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

主要儀器為三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱 （Heraeus）；酶標(biāo)儀（VERSAmax）；倒置相差顯微鏡（Nikon）。

（二） 方法

1.原代細(xì)胞培養(yǎng)

麻醉約200 g雄性SD大鼠，分離股動(dòng)脈和肺內(nèi)第二、三級(jí)肺動(dòng)脈，將分離的中層動(dòng)脈條浸于10% DMEM中5min后，離心管中切碎，將沉淀后的組織塊均勻地種于培養(yǎng)瓶，加含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4h，再輕輕地翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，絕對(duì)靜止培養(yǎng)3天。實(shí)驗(yàn)采用3-5代的PASMCs和AASMCs。

2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

分別用胰酶消化PASMCs和AASMCs，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并種于96孔板，密度為5×103細(xì)胞，常氧環(huán)境下（21%O2），貼壁培養(yǎng)24h。用含5%血清的DMEM饑餓處理24h后，分別放置于15%O2、10%O2、5%O2和3%O2的低氧環(huán)境以及21%O2的常氧環(huán)境，培養(yǎng)48h后，采用Wst-1在450 nm下測(cè)細(xì)胞的吸光度OD值，Wst-1的使用方法見使用說明書（碧云天）。

3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行分析。

二、結(jié)果

（一） 增殖結(jié)果

各低氧組PASMCs，培養(yǎng)第1天時(shí)，增殖緩慢，到第2天時(shí)迅速開始增殖，比常氧組明顯增多，48h測(cè)OD值發(fā)現(xiàn)，在10% O2、5% O2、3% O2處理?xiàng)l件下PASMCs與對(duì)照相比具有呈著性差異（P <0.01），而在15%O2處理?xiàng)l件下，無顯著性差異；低氧組AASMCs在15% O2、10% O2和5% O2處理?xiàng)l件下生長(zhǎng)速度與常氧對(duì)照組一致，而在3% O2條件下可發(fā)生增殖反應(yīng)且與對(duì)照相比呈著性差異（P<0.01），其余低氧條件下均無顯著性差異。結(jié)果表明細(xì)胞水平PASMCs比AASMCs對(duì)低氧更敏感。PASMCs與AASMCs的生長(zhǎng)曲線如圖1。

三、結(jié)語

PASMCs和AASMCs經(jīng)過15% O2、10% O2、5% O2和3% O2一系列低氧處理后，在15% O2濃度時(shí)，PASMCs已發(fā)生增殖反應(yīng)，但AASMCs不發(fā)生增殖反應(yīng)，當(dāng)氧濃度下降到3%時(shí)，AASMCs發(fā)生增殖反應(yīng)，二者均發(fā)生增殖反應(yīng)，表明細(xì)胞水平PASMCs比AASMCs對(duì)低氧更敏感。我們認(rèn)為，可能由于血管所處周圍氧環(huán)境差異所致，肺血管長(zhǎng)期處于富氧環(huán)境中，而體循環(huán)血管長(zhǎng)期處于低氧環(huán)境中，Han JA 報(bào)也道在低氧3% O2通過抑制平滑肌細(xì)胞eNOS活性，加強(qiáng)大鼠股深動(dòng)脈的收縮，提示肺動(dòng)脈與股動(dòng)脈對(duì)低氧反應(yīng)的本質(zhì)是一致的，只是發(fā)生低氧性血管收縮時(shí)的氧分壓不同而已，支持了主、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞對(duì)低氧的敏感度不同這一觀點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]羅穎，李志超，張齊.慢性低氧對(duì)大鼠主動(dòng)脈與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖影響的差異性[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2006，（04）.

[2]陶慧林，王懷良，郭偉，高山紅.幾種藥物對(duì)肺主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖作用影響的比較研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2005，（03）.

[3]魏冰，杜軍保，李簡(jiǎn)，等.高肺血流量對(duì)大鼠肺動(dòng)脈壓及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2002，（01）.

（作者簡(jiǎn)介：魏琪，碩士，西安培華學(xué)院 助教，研究方向：蛋白材料的制備及活性研究。）