基于線粒體12S rDNA序列分析巖扇貝與國內主要經濟扇貝的親緣關系

摘要：應用PCR擴增和測序技術獲得了引進種巖扇貝（Crassadoma gigantea）及我國主要經濟扇貝：蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensz‘s）、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）和海灣扇貝（Argopecten irradians）的12S rDNA全序列，并進行了相關分析。結果表明，四種扇貝12S rDNA的序列長度在906～964bp之間，其A+T含量在50.57%～56.77%之間；單倍型數、多態性位點數、單倍型多樣性指數、核苷酸多樣性指數和平均核苷酸差異數分別在2～3、2～3、0.264～0.623、0.00075～0.00207和0.427～1.882之間，均表現出較低的遺傳多樣性水平；種間遺傳距離在0.079～0.306之間，其中蝦夷扇貝與櫛孔扇貝的遺傳距離最近，其次是巖扇貝與蝦夷扇貝，而巖扇貝與海灣扇貝的遺傳距離最遠，并且系統進化樹分析結果顯示蝦夷扇貝先與櫛孔扇貝聚為一支，再與巖扇貝進行聚類，而海灣扇貝則與其它扇貝聚為另一個單系群，進一步闡明了四種扇貝間的親緣關系。

關鍵詞：12S rDNA；巖扇貝（Crassadoma gigantea）；遺傳變異；親緣關系 中圖分類號：Q959 文獻標志碼：A

巖扇貝（Crassadoma gigantea）隸屬于軟體動物門（Mollusca）、瓣鰓綱（Lamellibranchia）、珍珠貝目（Pterioida）、扇貝科（Pectinidae），原產于北美洲太平洋沿岸海域。因其具有生長速度快、肉質鮮美以及抗逆性強等特點，在國外市場備受歡迎。目前國內主要養殖的扇貝種類有櫛孔扇貝（Chlamys.farreri）、華貴櫛孔扇貝（Mimachlamys nobilis）、海灣扇貝（Argopectenirradians）和蝦夷扇貝（Patinopecten yessoen-sis）。然而，隨著扇貝養殖產業的迅猛發展，縱觀整個產業鏈存在諸多問題，如種質衰退嚴重、疾病災害頻發、品質下降等，而新物種的引進將成為解決問題的有效途徑之一。因此，大連海洋大學曹善茂教授于2012年從加拿大引進巖扇貝種貝并繁育成功。目前，有關巖扇貝的研究主要集中在生理生態等方面，其遺傳學研究在國內外卻鮮見報道。作為外來引進新物種，對其遺傳學及種質資源的評估資料仍處短缺狀態，這將給生產應用帶來很大困擾。

線粒體DNA具有母性遺傳、結構簡單、大小適中、缺乏重組、進化速率相對較快等特點，已廣泛應用于種群遺傳學、系統發生學和分子進化等相關研究，其中rRNA基因同時具有易變區和保守區，目前已作為可靠的分子標記廣泛應用于動物的分子進化和系統發生等相關研究。因此，擬通過測定巖扇貝、櫛孔扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝的mtDNA 12S rDNA序列，分析其遺傳變異趨勢，并結合GenBank其他扇貝的相應的基因序列進行系統進化分析，從分子水平上了解巖扇貝的遺傳背景及其系統進化地位，以期為巖扇貝今后的遺傳育種研究工作提供部分基礎信息。

1材料與方法

1.1實驗材料

本研究所使用的巖扇貝為由加拿大溫哥華引進的種貝的F₁代個體，為1齡貝養殖于大連龍王塘海域（代表符號：Y）；蝦夷扇貝（代表符號：X）、櫛孔扇貝（代表符號：Z）均購自于大連新長興海產品市場，為2～3齡貝；海灣扇貝（代表符號：H）取自于山東萊州某養殖場，為1～2齡貝。采樣時間均為2017年5月，每個種隨機取10個樣本，經形態學鑒定后取閉殼肌保存于無水乙醇中備用。

1.2實驗方法

1.2.1基因組DNA提取 參考Sambrook等的酚/氯仿抽提法并略做修改。取2μL基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測基因組DNA的完整性，并取1μL在NanoDrop 2000微量分光光度計上測定濃度，最后稀釋成約50ng/μL的工作液保存于4℃備用。

1.2.2引物 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。櫛孔扇貝、蝦夷扇貝及海灣扇貝的12S rDNA序列擴增根據GenBank中該物種線粒體基因組全序列設計特異性引物，使用Primer5軟件進行引物設計，引物序列具體為：櫛孔扇貝F：5-TTTCTGCTCCGTGGTGTA-3，R：5-ATAGCCCTGCCCATAAGTT-3；蝦夷扇貝F：5-：GTCGGACTTGGTC GTA-CAT-3R：5-ATAGCCCTGCCCA TAAGTT-3；海灣扇貝F：5-AGCCTTCAGCCTA-AATGT-3R：5-TCACCAC CAACCGAAT-AG-3；而巖扇貝的12S rDNA序列則通過其它三種扇貝跨種擴增獲得。

1.2.3測序 PCR反應總體系為25μL，包括1μL模板DNA（50ng/μL），2.5μL 10×reactionbuffer，1.0μL dNTP MIX（2.5 mM），1.0μL上下游混合引物（各10μM），0.2μL 1 U Taq DNA聚合酶，18.8μL超純水；PCR反應條件是：94℃預變性5min；94℃變性35s，50℃退火40s，72℃延伸40s，進行38個循環；最后72℃充分延伸10min。PCR產物經BioSpin GelExtraction Kit純化回收后，連接到pMDl8-T載體上，再轉化到大腸桿菌感受態細胞DH5α，挑選陽性克隆送天一輝遠（武漢）生物科技有限公司進行雙向測序。

1.2.4數據分析 測序結果使用BioEdit7.0進行序列拼接；使用NCBI的BLAST工具搜索其它貝類的同源序列，下載扇貝科7種扇貝以及外源群兩種貽貝的Cytb基因的同源序列（信息見表1）；ClustalX1.83對不同物種的DNA序列進行多重比對，使用GeneMarkS4.6b軟件對巖扇貝的測序結果進行12S rRNA基因的預測；使用DNAsp5分析核酸基本參數，MEGA5.1計算堿基組成和遺傳距離，并基于Neighbor-joining（NJ）法構建系統發育樹。

2結果

2.112S r DNA序列得堿基組成

利用PCR測序技術獲得了四種扇貝的12SrDNA全序列，堿基組成結果如表2所示。首先，四種扇貝12S rDNA序列長度在909～964pb之間，最長的為蝦夷扇貝，其次是櫛孔扇貝，最短的為巖扇貝。四種扇貝的A、T、G、C含量分別在27.709/6～29.59%、23.55%～27.17%、26.40%～28.61%和16.83%～20.81%之間，其A+T含量在50.57%～56.77%之間，最高為巖扇貝，最低為櫛孔扇貝，但均大于G+C含量。

2.212S r DNA序列的遺傳多樣性

基于12S r DNA序列獲得的四種扇貝的遺傳變異參數如表3。首先，巖扇貝、櫛孔扇貝、蝦夷扇貝和海灣扇貝分別獲得3、2、3、2個單倍型，無共有單倍型，多態性位點數依次為2、2、2、3，所有核苷酸變異位點均為轉換和顛換變異（多態性核苷酸位點及各單倍型分情況詳見表4）。四種扇貝的單倍型多樣性指數（Hd）在0.264～0.623之間，其中巖夷扇貝最高，其次是蝦夷扇貝，而櫛孔扇貝最低；核苷酸多樣性指數（7c）在O.00075～0.00207之間，其中海灣扇貝的值最高，其次是巖扇貝，而櫛孔扇貝最低；平均核苷酸差異（k）在0.427～1.882之間，其中最高值為海灣扇貝，其次是巖扇貝，而櫛孔扇貝。所有遺傳變異參數中，π值和k值之間呈正相關關系。

2.3種間遺傳距離及系統發育樹

利用獲得的所有12S r DNA序列計算了四種扇貝種間遺傳距離，結果如表5。四種扇貝的遺傳距離在0.079～0.306之間，其中櫛孔扇貝與蝦夷扇貝之間的遺傳距離最近，之后依次為巖扇貝與蝦夷扇貝（0.094）、巖扇貝與櫛孔扇貝（0.105）、櫛孔扇貝與海灣扇貝（0.280）、蝦夷扇貝與海灣扇貝（0.289），而巖扇貝與海灣扇貝之間的遺傳距離最遠。

2.4系統發育樹構建

利用獲得的四種扇貝的所有12S r DNA單倍型序列，并結合GenBank數據庫中其他扇貝的相應序列，基于鄰接法Neighbor-Joining（NJ）構建系統發育樹，選取蚶科的兩個種作為外源群，結果如圖1。除外源群物種獨自聚為一個分支以外，扇貝科的所有物種分為兩個單系群，其中一個單系群包括蝦夷扇貝的3個單倍型、櫛孔扇貝的2個單倍型、巖扇貝的3個單倍型以及Mimachlamys、Pecten兩個屬的物種，每個屬的物種又獨自聚為一個小分支，具體為蝦夷扇貝先與櫛孔扇貝聚為一支，再與巖扇貝聚類，之后與Mimachlamys聚類，最后與Pecten聚為一個單系群；而Argopecten的四個種則獨自聚為另一個單系群，其中海灣扇貝與其亞種墨西哥海灣扇貝聚為一個小分支，而另兩個種聚為一個小分支。

3討論

3.112S r DNA的序列特征及遺傳多樣性

DNA序列分析是鑒定生物親緣種，研究系統進化關系的方法之一。12S rRNA屬線粒體基因，在動物進化機制和系統發育研究上是一種有效的分子標記。本研究獲得的四種扇貝的12Sr DNA全序列經Clustal比對發現，四種扇貝的12S r DNA序列同源性較低，種間變異較大。但四種扇貝的序列長度并無明顯的種間長度多態，這在其它動物的研究中也存在類似的現象。另外，四種扇貝的12S r DNA序列的A+T含量均大于G+C含量，符合動物線粒體基因的堿基組成特征，并與其它貝類的研究結果相一致。

遺傳多樣性是物種延續和發展的基礎，其豐富的種群在復雜多變的自然環境中表現出更強的適應性。而通常來說，核苷酸多樣性指數（π）和單倍型多樣性指數（Hd）是評估種群遺傳多樣性的兩個重要指標，但由于單個堿基的變異就能生成一種新的單倍型，Hd值可在短時間內積累變異而快速提高，而丌值的提高需要長時間的積累，因此兀值在衡量種群遺傳多樣性時比Hd值更具代表性。本研究中，四種扇貝的π值在0.00045～0.00207之間。但Lan等認為，當π值低于0.0047時，則表明遺傳多樣性處于較低水平，說明本研究中采樣區的四種扇貝均表現出較低的遺傳多樣性水平。其原因可能與實驗樣本均為養殖群體有關。

3.2遺傳距離及系統發育分析

物種間的遺傳距離是衡量其親緣關系的重要指標。本研究中櫛孔扇貝與蝦夷扇貝之間的遺傳距離最近，表明其親緣關系最近，此部分結果與秦艷杰等應用AFLP技術的研究結果一致，而巖扇貝與海灣扇貝之間的親緣關系較遠。其次，巖扇貝與其它三種扇貝之間則表現為巖扇貝與蝦夷扇貝的親緣關系最近，而與海灣扇貝之間的親緣關系較遠。

目前，在扇貝系統進化方面已有大量的研究報道，如Insua等和Jose Lopez-Pinon等分別利用ITSI和5S rDNA序列對歐洲的四種扇貝進行了親緣關系探討；胡麗萍等和Canapa等利用16S rDNA部分序列進行了相關研究；而Barucca等和Puslednik等則同時利用16S rDNA和12S rDNA序列構建了扇貝的系統進化樹。其中，Puslednik等的研究對象較為豐富，包括本研究中的蝦夷扇貝、海灣扇貝以及引進種巖扇貝在內，但該研究獲得的僅為相應基因的部分序列，而非基因全序列。盡管缺失了櫛孔扇貝，但其結果顯示蝦夷扇貝與Chlamys的冰島扇貝獨自聚為一個分支，再與巖扇貝進行聚類，而海灣扇貝則與其它扇貝聚在另外一個大分支。本研究中蝦夷扇貝與櫛孔扇貝聚為一個分支，再與巖扇貝進行聚類，而海灣扇貝聚為另一個單系群。兩者的研究表現出極大的相似性。

4結論

綜上所述，本研究利用PCR擴增及測序技術，獲得了巖扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝和櫛孔扇貝的mtDNA 12S r DNA全序列，并進行了遺傳變異水平及系統進化分析。結果表明：采樣區四種扇貝均表現出較低的遺傳多樣性水平，并且四種扇貝之間，蝦夷扇貝與櫛孔扇貝的遺傳距離最近，其次是巖扇貝與蝦夷扇貝，而巖扇貝與海灣扇貝的遺傳距離最遠，闡明了四種扇貝之間的親緣關系。該研究結果將為巖扇貝的引種與推廣養殖以及今后的遺傳育種研究工作提供參考信息。

（收稿日期：2017-12-27）