中空纖維膜微萃取/超高效液相色譜法檢測大腸桿菌中氨基酸的研究

李 儀,趙雙麗,張 炎,何品剛,王清江

(華東師范大學 化學與分子工程學院，上海 200241)

大腸桿菌生長迅速，營養需求簡單，是一種重要的工業微生物之一[1]。目前，大腸桿菌的代謝組學主要是研究遺傳或環境擾動后生物體內小分子代謝物的變化情況，其代謝物主要有氨基酸、磷酸糖、有機酸、核苷等極性物質，其中氨基酸作為構成生物體蛋白質最基本的物質，占代謝物總含量的比例較高，因此準確測定大腸桿菌中氨基酸的含量具有重要意義[2]。

基于生物體基質復雜和代謝物含量低的特點，樣品前處理是檢測過程中不可缺少的重要環節[3]。生化樣品中氨基酸的預處理方式主要有離心過濾[4]、分散液液微萃取[5]、選擇性沉淀[6]、中空纖維膜液相微萃取[7]。其中，中空纖維膜液相微萃取的樣品純化能力好、富集倍數高、有機試劑用量少，而且中空纖維膜一次性使用，避免了交叉污染，提高了樣品測試結果的準確度[8]，因此近年來日益得到重視。

常見的氨基酸分離方法有高效液相色譜法[9]、陰離子交換色譜法[10]、毛細管電泳法[11]、氨基酸分析儀測定法[12]等，與之聯用的檢測方法有質譜檢測[13]、電化學檢測[10]、紫外檢測(包括二極管陣列檢測)[14]、激光誘導熒光檢測[15]等。柱前衍生/高效液相色譜法因靈敏、快速而被廣泛用于氨基酸的測定[16]。趙先恩等[5]采用原位超聲輔助衍生分散液液微萃取技術結合UHPLC-MS/MS分析了阿爾茨海默病大鼠尿中氨基酸和單胺類神經遞質及其代謝產物，所用質譜技術無需標準品和衍生化，但儀器較昂貴。熒光法檢測氨基酸主要采用柱前衍生，衍生試劑有鄰苯二甲醛(OPA)[17]、異硫氰酸苯酯(PITC)[18]、二硝基氟苯(DNFB)[19]等。氨基酸也可與乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)[14]反應形成氨基烯酮衍生物，該衍生物可用二極管陣列檢測器檢測。DEEMM作為衍生試劑，具有反應條件要求不高、反應迅速、衍生產物穩定等優點，且在衍生過程中可以完全降解過量的衍生試劑[20]。

在不同外界環境的影響下，大腸桿菌中的氨基酸含量和種類均會變化。本實驗在Luria-Bertani(LB)培養基的條件下培養大腸桿菌，采用中空纖維膜液相微萃取/超高效液相色譜聯用技術，以DEEMM為衍生試劑，建立了大腸桿菌中8種氨基酸的超高效液相色譜測定方法。本方法準確可靠，為大腸桿菌菌體中氨基酸的分析提供了新方法。

1 實驗部分

1.1 菌株、儀器與試劑

標準大腸桿菌菌株ATCC25922購于上海魯微科技有限公司。UHPLC-30A超高效液相色譜儀(島津公司)，配二元泵、在線脫氣和二極管陣列檢測器；高壓滅菌鍋(上海三申醫療器械有限公司)；Q3/2 Accurel PP 聚丙烯微孔中空纖維膜(壁厚 200 μm，內徑600 μm，孔尺寸 0.2 μm，多孔性75%)購自德國Membrana公司；KQ-2200DE超聲清洗儀(昆山舒美超聲儀器有限公司)；高速離心機(上海盧湘儀有限公司)；ME104E電子天平(梅特勒-托利多國際貿易有限公司)；賽多利斯pH計(PB-10型，賽多利斯上海貿易有限公司)；旋渦混合器(其林貝爾 VORTEX-5儀器制造有限公司);0.22 μm一次性微孔濾膜(北京芯硅谷科技有限公司)。

蛋白胨與酵母膏購于北京奧博星生物技術有限公司。氨基酸對照品：L-賴氨酸(Lys)、L-絲氨酸(Ser)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)、L-谷氨酸(Glu)、L-谷氨酰胺(Gin)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-天門冬氨酸(Asp)。甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。衍生試劑乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)購于阿拉丁生化科技股份有限公司，實驗用水為超純水。

1.2 溶液配制

硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)：稱取0.618 3 g硼酸，加9 mL水使其溶解，用1 mol/L的NaOH溶液調至pH 9.0后，加水稀釋至10 mL，得到1 mol/L硼酸鹽緩沖液。

醋酸鹽緩沖液(pH 6.7)：稱取1.025 g醋酸鈉，加水至450 mL，用冰醋酸調至pH 6.7，然后加水稀釋至500 mL，得到25 mmol/L醋酸鹽緩沖溶液。

標準溶液：分別準確稱取1 mmol的Lys、Ser、Trp、Tyr、Glu、Gin、Phe、Asp標準品，用0.1 mol/L鹽酸定容至10 mL(其中Tyr用0.1 mol/L NaOH溶解)，得到8種氨基酸的0.1 mol/L標準儲備液，于4 ℃冰箱保存。

1.3 樣品前處理

配制LB液體培養基150 mL于錐形瓶中，滅菌。取凍存的大腸桿菌接種到錐形瓶中，37 ℃搖床培養24 h。將菌體與培養基分離后，加入滅菌后的蒸餾水，以8 000 r/min離心6 min，棄去上清液。之后再加入滅菌后的蒸餾水，重復以上操作1次，得到大腸桿菌菌體。在含有菌體的離心管中加入1 mL 50%甲醇溶液，旋渦混勻后，于-20 ℃下放置15 min后取出，于37 ℃水浴中放置15 min，旋渦混合，重復上述凍融過程2次。再以8 000 r/min離心6 min，取上層清液進行衍生。

1.4 衍生化方法

氨基酸的DEEMM衍生參照文獻[20]方法。準確吸取不同濃度的標準溶液或大腸桿菌菌體提取液200 μL，加入350 μL 的1 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)、150 μL甲醇和3 μL的DEEMM衍生試劑，于30 ℃下超聲45 min。然后于70 ℃下加熱2 h，經0.22 μm濾膜過濾后待萃取。

1.5 UHPLC條件

色譜柱為Shim-Pack GISS C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)，流速為0.2 mL/min，柱溫為25 ℃，流動相為體積比45∶55的甲醇-25 mmol/L醋酸鹽水溶液(pH 6.7)，最佳吸收波長為280 nm，進樣量為10 μL。

1.6 富集條件

將中空纖維膜剪成長度約5 cm，置于丙酮中超聲清洗10 min后在通風櫥中自然風干，熱封一端后，將接收液注入中空纖維膜，熱封另一端，使中空纖維膜處于“封閉”環境。最佳萃取條件為：給出相體積8 mL，其中鹽酸濃度為5.0 mmol/L，NaCl質量濃度為200 g/L；接收相體積為8 μL，NaOH 濃度為0.3 mol/L；液膜(SLM)為正辛醇；萃取溫度為25 ℃；攪拌速度為500 r/min；萃取時間為4 h。

圖1 8種氨基酸的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of eight amino acids standard solution by UHPLC1.Asp;2.Glu;3.Ser;4.Gin;5.Phe;6.Lys；7.Tyr；8.Trp；c=14.0 μmol/L

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

實驗對流動相的種類、有機相含量以及水相的pH值進行了優化。對于UHPLC檢測，通常在水中加入甲醇和乙腈等洗脫能力較強的溶劑。分別考察了體積分數為25%、35%、45%、55%的甲醇或乙腈作為流動相時對氨基酸分離的影響。考慮到氨基酸為兩性物質，不同緩沖液pH值會對其離解程度有影響，從而影響氨基酸的保留值，實驗考察了流動相水相(25 mmol/L醋酸鹽水溶液)的pH值分別為6.1、6.3、6.5和6.7時8種氨基酸的分離效果。實驗結果表明，當甲醇為45%，25 mmol/L醋酸鹽水溶液的pH值為6.7時，8種氨基酸可在1～4 min內完全分離，標準譜圖見圖1。故本實驗選擇流動相為甲醇-25 mmol/L醋酸鹽水溶液(pH 6.7)(45∶55，體積比)。

2.2 液相微萃取條件的優化

2.2.1接收相與給出相溶液濃度的優化氨基酸是兩性電解質，其離子化過程分兩步進行。因液相微萃取需通過調節pH值使被測物質在給出相中呈分子狀態,才能通過中空纖維膜的有機相進入接收相中，所以接收相和給出相溶液的pH值非常重要。實驗考察了接收相NaOH溶液濃度(0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L)對氨基酸衍生物富集效率的影響。結果表明，8種氨基酸衍生物的富集倍數(EFs)在NaOH溶液濃度為0.30 mol/L時達最大，因此選擇NaOH溶液濃度為0.30 mol/L。然后考察了給出相鹽酸濃度(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mmol/L)對氨基酸衍生物的影響。結果發現隨著給出相中鹽酸濃度的增加，8種氨基酸衍生物的富集倍數(EFs)明顯提高，當鹽酸濃度為5.0 mmol/L時，繼續增加鹽酸濃度，各氨基酸衍生物的EFs開始下降。所以選擇給出相鹽酸濃度為5.0 mmol/L。

2.2.2NaCl濃度的優化由于分析物在有機溶劑和樣品之間的分配系數受樣品基體的影響，向樣品溶液中加入NaCl等無機鹽可增強溶液的離子強度。而鹽析效應會降低待測物在樣品中的溶解度，從而提高樣品在萃取相中的分配，進而提高萃取效率。實驗考察了NaCl的質量濃度在100～300 g/L范圍內對萃取的影響。結果表明，8種氨基酸的EFs在NaCl質量濃度為200 g/L時達到最大，因此選擇在樣品溶液中加入200 g/L的NaCl。

圖2 溫度對富集倍數的影響Fig.2 Effect of the extraction temperature on EFs of eight amino acids compounds

2.2.3萃取溫度的優化萃取溫度對萃取過程有動力學和熱力學的雙重影響。在萃取過程中，當溫度升高時，待萃取物質的質量傳遞系數增大，擴散速度加快，萃取效率隨之提高。但萃取溫度過高會加大有機溶劑在水中的溶解度，從而影響給出相和支撐液膜的穩定性，或導致給出相中的水分揮發過快，使得目標分析物的富集倍數不穩定。實驗考察了萃取溫度(20、25、30、35、40 ℃)對萃取效率的影響(圖2)，發現8種氨基酸的EFs在25 ℃時達到最大，因此選擇25 ℃為最佳萃取溫度。

2.2.4萃取時間的優化動態的三相HF-LPME是基于待測物在樣品溶液與萃取相之間分配的過程，所以在萃取達到平衡時，待測物的萃取效率最高。一般而言待萃取物進入接收相溶液中的量隨著萃取時間的延長而增加，直至某一平衡點達到最大值。本實驗考察了萃取時間分別為2、3、4、5、6 h時8種氨基酸的萃取效率。結果顯示，8種氨基酸的EFs在萃取4 h時達到最大。當萃取時間超過4 h時，接收相溶液的體積明顯減少，且EFs明顯降低。基于此，選擇4 h為最佳萃取時間。

2.2.5攪拌速度的優化采用磁力攪拌能促進給出相的分散以及目標分析物的轉移，縮短萃取時間，進而提高EFs。但攪拌過快會加速萃取溶劑分散到提取液中，從而降低萃取效率。當攪拌速度大于500 r/min時，給出相溶液出現渦流現象，中空纖維膜表面的有機相膜易被破壞，從而導致富集效率減小。實驗考察了給出相的攪拌速度(200～500 r/min)對萃取效率的影響。結果表明，攪拌速度為500 r/min時，8種氨基酸的EFs達到最大值，因此選擇500 r/min為最佳攪拌速度。

依據萃取后接收相中分析物的濃度和萃取前樣品中分析物的初始濃度之比得到富集倍數。在“1.6”最佳富集條件下，中空纖維膜微萃取對8種氨基酸的富集倍數達110～290倍(見表1)。

2.3 方法驗證

2.3.1線性范圍與檢出限分別準確移取0.25、1.0、2.5、10、25 mmol/L的氨基酸混合標準溶液，按照本方法進行衍生化、萃取和分離測定。由表1可見，8種氨基酸在0.20～4.9×103μmol/L濃度范圍內線性關系良好，相關系數r2均大于0.999。

在最優色譜分離條件下，將標準溶液進行稀釋、分析，根據3倍信噪比得到相應的檢出限(LOD)。由表1可見，8種氨基酸的檢出限為0.08～0.35 μmol/L。該方法的靈敏度高，可以滿足樣品的測定要求。

表1 8種氨基酸的線性關系、相關系數、檢出限與富集倍數Table 1 The linear relationships,correlation coefficients,detection limits and enrichment factors of eight amino acids

*y:peak area;x:mass concentration(μmol/L)

2.3.2穩定性、精密度、重復性與回收率取200 μL濃度為2.5 mmol/L的標準溶液衍生后，連續進樣5次測定色譜峰的峰面積，計算8種氨基酸的相對標準偏差(RSD)為0.54%～3.3%(n=5)；再將其衍生的標準品在室溫放置12、24、36、48 h后進行測定，計算得RSD為0.19%～4.9%(n=5)；取同一樣品5份，經提取、衍生后測定色譜峰面積，得到RSD為0.32%～5.2%(n=5)。以上結果表明，該方法的精密度、重復性與穩定性較好，可用于大腸桿菌中氨基酸的分析檢測。

同時對大腸桿菌樣品進行加標回收實驗，結果如表2所示，樣品在5、10、50加標濃度下的回收率為88.7%～103.1%，RSD為3.2%～4.3%(n=5)，表明提取溶劑的基質效應對分析物的定量分析影響較小。

表2 8種氨基酸的加標回收率及相對標準偏差(n=5)Table 2 Recoveries and RSDs of six sulfonamides(n=5)

圖3 空白大腸桿菌樣品(A)和大腸桿菌加標樣品(B)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of the blank(A)and spiked(B,10 μmol/L) of the E.coli.1.Asp;2.Glu;3.Ser;4.Gin;5.Phe;6.Lys；7.Tyr；8.Trp

2.4 實際樣品檢測

以DEEMM為柱前衍生試劑，在最優萃取條件下進行處理，采用UHPLC檢測大腸桿菌中的氨基酸，空白樣品和加標樣品的色譜圖見圖3。結果表明，在大腸桿菌中均檢出此8種氨基酸，Asp、Glu、Ser、Gin、Phe、Lys、Tyr和Trp的濃度分別為20.45、26.11、7.53、7.47、7.51、8.93、7.31、7.70 μmol/L，其中Glu的含量最高，其次為Asp。

3 結 論

本文通過對色譜條件和液相微萃取條件的優化，建立了一種中空纖維膜液相微萃取/超高效液相色譜測定大腸桿菌中8種氨基酸的方法。檢出限、精密度、回收率等方法學的考察結果表明，本方法操作簡單，靈敏度和穩定性高，適用于細菌中氨基酸的定量分析。