青稞類鈣調素蛋白基因 CML19的克隆、序列分析及原核表達

韋澤秀，原紅軍,扎 桑，王玉林，徐齊君，曾興權，尼瑪扎西,4

(1.西藏自治區農牧科學院 農業資源與環境研究所，拉薩 850002；2.省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850002；3.西藏自治區農牧科學院 農業研究所，拉薩 850002；4. 西藏自治區農牧科學院，拉薩 850002)

青稞(Hordeumvulgare. L. var.nudumHK.f.)為禾本科大麥屬，又名裸大麥、米大麥，含有豐富的β-葡聚糖、膳食纖維、支鏈淀粉，為藏族人民的主要糧食作物，其產量直接關系到藏區人民的經濟和生活。青稞主要生長在海拔高、溫度低、日照長、晝夜溫差大的地區，對環境的抗逆性較強[1]。近年來，研究者先后對青稞的抗鹽性[2]和抗旱性[3]等進行研究，以期明確青稞的抗逆機制，篩選有應用價值的基因，為選育抗逆性強的優良品種提供理論依據。

類鈣調素蛋白(CaM-like protein，CML)是一類廣泛存在植物中的與鈣調素蛋白同源的Ca2+結合蛋白，通常含有1～6個結合Ca2+的EF手單元[1]。類鈣調素與鈣調素一樣，具有廣泛的生物學功能，如調節植物細胞的形態與分裂[4-5]、調節植物開花和自體吞噬[6-7]、調節花粉粒萌發和花粉管伸長[8-9]、參與植物生長發育過程中的光信號和激素信號[10-11]，響應ABA、鹽、紫外光、低溫等多種逆境脅迫[12-15]及調節植物對病原菌的防衛反應[16-17]等。在擬南芥中的研究發現，CML42功能缺失突變體的表皮毛分支數增加[4]、開花延遲[7]，CML9能夠調節ABA介導的脅迫應答[12]，CML18參與鹽脅迫信號的轉導[18]。鑒于CML蛋白功能的多樣性，筆者采用轉錄組測序和抑制性差減雜交技術篩選青稞抗寒性相關基因，發現類鈣調素蛋白基因 CML19(GeneBank登錄號：XM_020329835)，為進一步了解該基因的相關信息，本研究以青稞為材料，對 CML19基因進行克隆、序列分析及原核表達。

1 材料與方法

1.1 材 料

青稞種質‘喜馬拉雅8號’和‘青稞320’由西藏自治區農牧科學院提供。

1.2 方 法

1.2.1 青稞種苗轉錄本的提取及反轉錄 取適量的青稞種子播種于富含有機質的盆栽土壤中，正常澆水管理，待植株生長至4葉期時，采用Jena InnuPREP RNA Mini Kit(Thermo Fisher公司)提取新鮮葉片RNA，采用反轉錄試劑盒TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit(Aidlab公司)進行反轉錄，cDNA樣本-20 ℃保存。

1.2.2 CML19基因的克隆 以轉錄組測序分析結果為基礎，利用Primer Premier 5.0 軟件設計特異引物CML19-F：5′-ATTGCGGGATCC- ATGGTGCACGCTGCGAC-3′和CML19- R：5′-ATTGCCCTCGAGCTACGCATCCATCATAA-CC-3′，下劃線分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。RT-PCR反應在S-1000 Thermal Cycler進行。PCR反應體系20 μL，包括TaqDNA聚合酶(TaKaRa，5 U/μL) 0.2 μL，10×PCR反應緩沖液(Takara) 2 μL，dNTP(10 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA 2 μL，滅菌水12.6 μL。擴增反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，34 個循環；72 ℃延伸10 min。用凝膠回收試劑盒回收目的片段，采用TaRaKa公司的DNA A-Tailing Kit加A后，連接于pMD18-T載體上，轉化后挑陽性克隆測序。

1.2.3 CML19基因的序列分析 利用NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)的ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和Conserved domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、DISPHOS(http://www.dabi.temple.edu/disphos/)、InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Signal IP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、PredictProtein(https://ppopen.rostlab.org/)、NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)等在線工具對 CML19進行序列分析。根據推測的氨基酸序列，利用MEGA5.1軟件進行氨基酸序列的同源性比對和進化樹分析。

1.2.4 原核表達載體的構建及轉化 將測序正確的陽性重組質粒pMD18- CML19與表達質粒PET28a(+)分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，凝膠回收目標片段，使用T4DNA連接酶于16 ℃連接過夜，轉化后挑單克隆振蕩培養，酶切鑒定陽性重組質粒。將鑒定正確的陽性質粒pET28a-CML19轉化表達宿主菌BL21(DE3)感受態細胞，同時將空載體pET-28a(+)轉化表達宿主菌BL21(DE3)作為陽性對照，BL21(DE3)感受態細胞不轉化組作為陰性對照。

1.2.5 蛋白的誘導及檢測 分別挑單克隆接種于5 mL LB液體培養基(含卡那霉素100 μg/mL)，37 ℃振蕩培養至OD600約為0.5時，取1 mL按體積比1∶100接種于含Kan(卡那霉素)的LB液體培養基中；將100 mL培養液分為2份，其中1份加IPTG誘導表達，另1份不加IPTG作為對照，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續振蕩培養8 h。取IPTG誘導后菌液1 mL，離心，棄上清，沉淀用生理鹽水洗滌后，采用超聲波破菌法分別制備總蛋白、上清和沉淀樣品，對取得的蛋白進行SDS-PAGE檢測，觀察蛋白條帶[19]。對未誘導菌液做同樣處理，觀察表達情況，同時將轉化pET-28a(+)的BL21作為對照。

2 結果與分析

2.1 CML19基因的克隆

以電子克隆延伸得到的序列(GeneBank登錄號:XM_020329835)為基礎設計特異引物，以青稞苗期葉片的cDNA為模板進行擴增，獲得1個447 bp的cDNA片段(圖1)，測序分析顯示該片段為預期的 CML19基因CDS全長(圖2)。

1～2.青稞 CML19擴增結果 Gene amplification results of Tibetan Hulless Barley CML19;M. DNA markerⅢ

圖1青稞CML19基因凝膠電泳圖
Fig.1DNAgelblotanalysisofCML19fromTibetanHullessbarley

圖2 CML19基因測序結果Fig.2 Sequencing results of CML19 from Tibetan Hulless barley

2.2 CML19基因的序列分析

ORFfinder在線分析顯示， CML19基因CDS全長447 bp，編碼1個含148個氨基酸的多肽(圖3)。ProtParam分析表明， CML19基因編碼的多肽分子質量為16.46 ku，理論等電點(pI)為4.40，分子式為C702H1114N194O232S15，總平均親水性(GRAVY)為-0.176，不穩定系數為49.59，編碼的148個氨基酸中，包括31個帶負電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)，15個帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)，其余氨基酸為非極性、疏水性氨基酸和極性、中性氨基酸，表明該蛋白為不穩定的親水性蛋白。Disphos預測結果表明， CML19存在6個磷酸化位點(包括4個絲氨酸磷酸化位點，1個蘇氨酸磷酸化位點和1個酪氨酸磷酸化位點)，其中，只有1個絲氨酸磷酸化位點有功能(第26個氨基酸)。應用InterProScan和NCBI網站的Conserved domains分析顯示，CML19蛋白存在典型的EF結構域。TMHMM預測該蛋白不含跨膜轉移功能區。Signal IP 4.1預測該蛋白沒有信號肽，不屬于分泌蛋白。PredictProtein將該基因所編碼蛋白亞細胞定位于細胞質。

Blastn分析發現， CML19基因序列與山羊草、烏拉爾圖小麥、小米和短花藥野生稻等植物的CML基因全長cDNA序列的相似度分別為88%、84%、68%和68%，推導的氨基酸序列同源比對分析結果表明，該基因編碼蛋白與山羊草、烏拉爾圖小麥、小米、短花藥野生稻的CML蛋白的相似度分別為88%、84%、68%、67%。基于氨基酸序列的系統進化樹表明，青稞CML19蛋白與山羊草具有較近的親緣關系(圖4)。

NPS二級結構預測結果顯示，98個氨基酸屬于α-螺旋，占66.22%；9個氨基酸為延伸鏈，占6.08%；9個氨基酸屬于β-折疊，占6.08%；32個氨基酸屬于無規則卷曲，占35.02%。應用SWISS-MODEL建立該蛋白的三級結構，如圖5所示。

圖3 CML19基因的CDS序列和推測氨基酸序列Fig.3 CDS sequence and deduced amino acids of CML19

圖4 青稞CML19的系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CML19 from Tibetan Hulless barley

A：CML19蛋白的二級結構預測 The predicted secondary structure of CML19 protein; h.α-螺旋α-helix; e. 延伸鏈 Stretched chain; t.β-折疊β-sheet; c.無規則卷曲 Random coil

B：CML19蛋白的三級結構預測 The predicted tertiary structure of CML19 protein

圖5CML19蛋白的二級結構和三級結構預測
Fig.5ThepredictedsecondaryandtertiarystructureofCML19protein

2.3 CML19基因的原核表達

利用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質粒，得到的片段與預期大小相同(圖6)，進一步測序分析顯示，CML19插入片段完全正確，未發生任何堿基突變。將重組質粒導入BL21(DE3)后，經IPTG誘導8 h后收集菌體進行SDS-PAGE分析，結果顯示融合蛋白誘導成功，與預期大小(16.46 ku)相近，融合蛋白主要存在于菌體沉淀中，上清中極少(圖6)，表明得到的CML19誘導蛋白主要以包涵體形式存在。

A:M. DNA maker; 1. pET28a- CML19雙酶切產物 The product from pET28a- CML19 by double enzyme digestion

B:M．標準蛋白分子質量 Protein marker; 1. 未誘導 Uninduced;2. 誘導后全菌 Whole bacteria after induced; 3. 誘導后上清 Supernatant of induction; 4. 誘導后沉淀 Precipitation of induction

圖6pET28a-CML19重組質粒的雙酶切(A)和重組蛋白的SDS-PAGE分析(B)
Fig.6AnalysisofpET28a-CML19recombinantplasmiddigestedbydoubleenzymes(A)andSDS-PAGEoftheexpressedprotein(B)

3 討 論

中國是大麥的起源地之一，種質資源極為豐富，尤其是裸粒類型占有特別突出的地位，裸大麥在中國西藏、青海等地常稱為“青稞”。青稞具有豐富的營養價值和突出的醫藥保健作用。在高寒缺氧的青藏高原，不乏百歲老人，這與常食青稞及青稞突出的醫療保健功能是分不開的。和其他作物一樣，現代青稞選育亦是以高產、優質和抗逆為主要目標，因此研究其遺傳背景對于選育高產優產抗寒的農作物具有重要意義。

植物的生長發育和逆境響應不是相互孤立, 而是緊密聯系的。不良環境條件引起植物產生的生理反應有利于植物適應環境脅迫以完成整個生命周期。其中，Ca2+信號在植物生長發育和逆境響應過程中具有重要作用，由于植物生長的環境具有動態變化和充滿脅迫的特點, 鈣感受器的多樣性和豐富性可能對植物生長發育和生殖的順利完成至關重要。CML 作為一類鈣感受器, 對其生理功能的研究有助于明晰 Ca2+信號介導的調控網絡并解答鈣感受器如何解讀鈣信號并產生特異性反應。基因芯片等基因表達數據表明，很多CML基因對各種非生物脅迫都有不同程度的響應[1,13-15]，如擬南芥 CML6、CML17、CML28、CML37、CML40、CML44和 CML50等受鹽和干旱誘導， CML8、CML13、CML18和 CML25等受鹽和干旱抑制[1,13,20]。水稻CML基因 OsMSR2也受多種非生物脅迫誘導，而且過量表達 OsMSR2使轉基因植物對ABA 的敏感性增強，對鹽和干旱的抗性也增強[1, 21]。人們發現 CML19功能敲除突變體cml19 以及 CML19沉默的突變體對UV脅迫都更敏感，并且它們在體外DNA 損傷修復的效率都降低，而過量表達 CML19使植物DNA 損傷的修復增強[1, 22]。進一步研究表明，UV 脅迫促進CML19蛋白的表達，而且UV脅迫使CML19 從細胞質快速轉移至細胞核[1, 23]。本試驗克隆得到的青稞CML19的功能尚不清楚，利用轉錄組測序和抑制性差減雜交技術篩選青稞抗寒相關基因的過程中發現， CML19包含其中，推測其與青稞的抗寒性相關。因此，需要對 CML19基因進一步克隆和序列分析，同時進行原核表達，探究其在體外的表達情況，為研究CML19蛋白與青稞的抗寒性奠定基礎。