水分管理對Cd-Pb-Zn污染土壤有效態及水稻根際細菌群落的影響

李海龍，李香真，2，聶三安，李云云，鄭朝元，王 果*

（1.福建農林大學資源與環境學院，福建省土壤環境健康與調控重點實驗室，福州 350002；2.中國科學院成都生物研究所環境與應用重點實驗室，環境微生物四川省重點實驗室，成都 610041）

水分管理是農業水稻生產的一項重要農藝措施。在重金屬污染的農田上，不同的水分條件能夠顯著影響水稻對重金屬如鎘（Cd）的吸收和富集[1]。例如，連續淹水能有效降低水稻對Cd的吸收[2]，這主要是由于在長期淹水的條件下，一方面Cd2+與Fe2+競爭吸附作用降低水稻對Cd2+吸收富集，另一方面還原條件下形成的S2-與Cd2+形成CdS從而降低Cd2+有效性[3]，或者淹水條件下促進了Cd向殘渣態的轉化[4]。而干濕交替管理，通過頻繁的土壤還原和氧化過程的轉換，直接影響土壤有機質和礦物結構[5-6]，并且氧化還原過程的循環也可以促進土壤重金屬如鉛和鎳的礦化過程，從而降低它們在土壤中的移動性[7-8]。可見，水分管理措施可以影響土壤中重金屬的移動性以及形態轉化。

微生物活動在土壤物質循環和離子遷移等方面起重要作用[9]，對于重金屬污染的土壤，王秀麗等[10]通過調查Cd、Pb、Zn和Cu復合污染土壤微生物群落結構發現，重金屬污染對于土壤細菌數量和群落結構均有影響。隨著重金屬污染程度的增加，能夠顯著降低土壤中細菌的數量[11]。這表明土壤中重金屬的含量對細菌群落結構和數量均有抑制性。近年來，土壤中細菌群落和重金屬形態之間的關系逐漸引起學者們的重視。Somenahally等[12]發現，長期淹水能夠有效提高土壤中鐵還原細菌（地桿菌和厭氧粘細菌）的相對豐度，促進了淹水環境下土壤中鐵、錳礦物的溶解，進而釋放出與鐵錳礦物相結合的重金屬離子。這說明微生物群落豐度的變化也能夠影響重金屬的形態轉化。

水稻根際區直接受根系分泌物和微生物過程的影響[13-14]，所以根際區土壤pH環境、氧氣含量、養分分布都不同于非根際土壤[15]。此外，近期研究報道也發現，水稻的根際和非根際細菌群落存在差異性，根表是植物吸收養分、重金屬元素的重要通道。因此相比于非根際區，根際區中土壤微生物、理化性質的變化更能影響水稻對于重金屬的吸收[16]。當前，針對水稻不同生長期根際區微生物的變化，以及在重金屬脅迫下的微生物群落產生哪些動態響應還不明確。

因此，本文研究了在長期淹水和干濕交替兩種水分方式下，Cd-Pb-Zn復合污染的農田土壤上水稻不同生長時期水稻根際土壤性質、細菌群落組成和結構的變化以及細菌群落與土壤環境因子之間的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究供試的土壤來自于福建省三明市尤溪縣某礦區附近的農田土壤（經度：118°15'17.91″，緯度：26°14'40.17″），該區域土地長期使用礦區的廢水澆灌。土壤基本理化性質如表1所示，Cd、Pb、Zn含量均顯著高于限定標準（GB 15618—1995），為典型的Cd-Pb-Zn復合污染的土壤。試驗的水稻品種為常規粳稻（臺粳9號），由莆田農科所提供。

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 physical and chemical properties of the soil

1.2 試驗設置

盆栽試驗于2015年7月至2015年11月在福建農林大學盆栽房中進行。試驗共有兩個處理組分別為整個生長期淹水（CF）和干濕交替（IF）。每個處理重復3次。具體為：準備6個相同規格（內徑25 cm，高24 cm）用75%的醫用酒精簡易滅菌的塑料桶。每一個塑料桶加7.5 kg風干土樣，再添加尿素（2.1 g）、NH4H2PO4（1.2 g）、K2SO4（2.1g）作為基肥與土壤混勻。所有處理組使用去離子水淹水，水層保持3～5 cm，穩定平衡3 d后用來種植水稻。

水稻種子用30%的雙氧水消毒30 min，用去離子水沖洗干凈后在濕潤的石英砂中發芽。一周后將發芽的水稻轉移到無重金屬污染的土壤繼續培養28 d。水稻幼苗于7月4日進行移栽，每盆5株。連續淹水處理：在水稻整個生長時期，保證盆中有3～5 cm的水層。干濕交替處理：水稻移栽后，先保持淹水狀態（1～2 cm淹水水層），然后自然蒸發，等到土壤表面有明顯的土壤裂紋，再進行下一次的淹水循環。

1.3 樣品采集

在水稻生長的分蘗期（移栽60 d）和成熟期進行土壤樣品采集。根際土壤的收集，采用經典的抖根法。用鏟子將水稻根系盡可能完整的取出，先將根系上多余的土壤抖掉，殘留在根系的土壤進行回收；然后將根系轉移到滅菌的離心管中，加入適量的超純水（18.2 MΩ·cm-1），5100×g下離心10 min，去掉管子中植物根系，倒掉管子中的上清溶液，固體部分冷凍干燥即為根際土壤。采集的根際土壤樣品分為兩份：一份用于DNA的提取，另外一份用于土壤有效態的提取。

1.4 測定方法

土壤Cd、Pb、Ni和Zn的總量測定采用王水（硝酸/鹽酸=1∶3，V/V）微波消解法，消煮過程用標準土樣（GSS-2，國家物質中心）作為質量控制[17]；土壤有效S、Cd、Pb、Ni和Zn采用0.01 mol·L-1CaCl2溶液，以1∶5土液比浸提[18-19]。Cd、Pb、Ni和Zn含量用電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS，Nex-ION300X，Perkin Elmer）測定；SO2-4含量由離子色譜儀（Themo Scientific X2100）測定；土壤pH（土∶水=1∶2.5）用pH計（Mettler-Seven Compact）測定；土壤機械組成采用激光粒度儀（BT-9300ST）測定；有效N含量采用堿解蒸餾法；有效磷采用Olsen法，由紫外分光光度計（TU-1810）測定。土壤有效N、P和S的測定添加標準土壤樣品（GBW07416a ASA-5，國家物質中心）作為質量控制。

1.5 土壤DNA提取及高通量測序分析

土壤DNA的提取使用的是試劑盒Power soil isolation kit（MO BIO Laboratories，Inc.）提取后的DNA濃度和質量由超微量紫外分光光度計（Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000c）測定。

微生物的引物采用細菌通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和 909R（5'-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3'），V4區作為細菌群落的特異識別區。PCR擴增反應采用25 μL體系，包括：1 μL的DNA模板；1.5 mmol·L-1MgCl2溶液，1 μmol·L-1的引物；1×PCR緩沖液和0.5U的ExTaq（TaKaRa，Shiga，Japan）。擴增條件設置：94℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，56℃退火60 s，72℃延伸60 s，30個循環。將PCR產物用1.2%濃度的瓊脂糖純化，采用擎科凝膠DNA回收試劑盒，根據測得DNA的濃度，每個樣品采集100 μg DNA混樣，高通量測序工作委托中國科學院大學成都生物研究所完成。基于IlluminaMiseq測序平臺進行16SrRNA基因的測序工作。原始DNA序列利用QIIME（V 1.7.0）軟件去除嵌合體，將序列重新優化，相似性達到97%以上的優化序列劃分到同一個可操作分類單元（OUT，Operational Taxonomic Units）。

1.6 統計分析

數據分析和圖形均由Sigmaplot 12.50和SPSS 19.0軟件完成，各處理之間的差異分析采用（One-way ANOVA）單因素方差分析，P＜0.05表示顯著差異。

2 結果

2.1 水分管理對于細菌群落多樣性的影響

水分管理對水稻根際細菌群落α多樣性指數的影響如表2所示。Chao1指數表征的是種群豐度，Chao1數值越大表明細菌群落豐富度越高；Shannon指數表征的是群落多樣性，Shannon數值越大表明細菌群落多樣性越高。由分析結果可知，在水稻分蘗期，CF處理盆栽中Chao1、Shannon與OUT數值均高于IF處理，其中Chao1指數增加達顯著水平（P＜0.05），這說明在該時期淹水條件下，根際細菌群落豐富度、多樣性均高于干濕交替條件的根際土壤。到了成熟期，兩種水分管理下細菌群落Shannon與OUT數值均有增加，CF處理盆栽Chao1指數降低，而IF處理三類指數均有明顯的增加，這也使得兩種條件對細菌群落α多樣性影響差異不明顯。

表2 兩種水分條件下細菌群落α多樣性Table 2 Effects of flooding regime on α diversity of bacteria

細菌群落結構組成差異性比較，將有讀數的OTU按照不同的水分處理進行主成分分析（Principal Component Analysis）。圖1分別表示兩種水分管理在水稻分蘗期（A）和成熟期（B）的細菌群落結構。圖A和圖B通過降維分析分別解釋了81.02%和81.18%菌群結構差異，其中分蘗期第一變量軸和第二變量軸分別解釋60.34%和20.69%菌群結構差異；成熟期群落結構，第一變量軸和第二變量軸分別解釋63.06%和18.16%菌群結構變異。由圖2可知，在水稻分蘗期，連續淹水和干濕交替兩種水分條件下，所有處理距離明顯，表明土壤OTU組成差異較大，水分管理對群落結構影響差異明顯；成熟期，IF處理菌群結構變動較大，而菌群結構受水分管理影響并不明顯。說明水分管理對細菌群落結構的影響主要表現在分蘗期。

2.2 水分管理對于細菌群落豐度的影響

兩種水分管理措施對細菌群落（門水平）相對豐度的影響見表3。所有處理的土樣（共12個）通過高通量測序分析發現，該土壤細菌群落主要由15個門類組成（相對豐度＞0.1%的細菌群落）。其中，變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度所占比例最高為（33.28±1.64）%～（55.69±0.47）%，是土壤中絕對的優勢菌門。其次，綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸酐菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、泉古菌門（Crenarchaeota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和藍菌門（Cyanobacteria）的相對豐度在所有處理中均在1%以上，是構成細菌群落的主要菌門。由表3分析結果可知，在水稻分蘗期，IF盆栽土壤變形菌門（Proteobacteria）相對豐度顯著低于CF處理，而厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度顯著高于CF處理；在成熟期，IF盆栽土壤變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度顯著低于CF處理，而芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對豐度顯著高于CF處理。從水稻分蘗到成熟期，對CF處理而言，變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度呈顯著降低趨勢，而綠彎菌門（Chloroflexi）和綠菌門（Chlorobi）的相對豐度呈顯著增加趨勢；對IF處理而言，厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度呈顯著降低趨勢，綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度呈顯著增加趨勢。

圖1 主成分分析（Principal Component Analysis）水稻分蘗期和成熟期兩種水分管理對根際細菌群落結構的影響Figure 1 Effects of flooding regime on bacteria community structure at rice tillering and repining stage through Principal Component Analysis

基于土壤中主要細菌門類（相對豐度均大于1%），在綱分類單元上，水分調控對細菌群落結構的影響如圖2所示（相對豐度低于0.1%和未命名的細菌群落未在圖中展示），將細菌門類菌綱個數小于3的歸類為other。本研究觀察到28個主要細菌綱類，水分調控對土壤中的δ變形菌綱（Deltaproteobacteria）、γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteriia）、芽孢桿菌綱（Bacilli）和芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）群落的相對豐度影響達到顯著水平（P＜0.05）。具體如下，在水稻分蘗期，CF盆栽土壤的γ變形菌綱相對豐度顯著高于IF處理，而芽孢桿菌綱的相對豐度顯著低于IF處理；到了水稻成熟期，CF盆栽土壤中δ變形菌綱的相對豐度顯著高于IF處理，芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）的相對豐度顯著低于IF處理。

表3 兩種水分管理措施對細菌群落（門水平）相對豐度（%）的影響Table 3 Effects of flooding regime on bacteria community relative（%）abundance at pylum taxa level

受水分管理表現差異顯著的5個細菌綱類，在科分類單元上細菌群落豐度組成如圖3所示。在δ變形菌綱（Deltaproteobacteria）下，連續淹水處理，粘球菌科（Myxococcaceae）、地桿菌科（Geobacteraceae）和脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）相對豐度明顯高于干濕交替處理，且在水稻分蘗期，脫硫弧菌科相對豐度淹水處理（0.45%）與干濕交替處理（0.01%）差異最大。到成熟期，地桿菌科相對豐度淹水處理（4.74%）與干濕交替處理（0.65%）差異最大；粘球菌相對豐度淹水處理（4.27%）與干濕交替處理（1.72%）差異明顯。在γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）下，在連續淹水處理，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）和莫拉菌科（Moraxellaceae）平均相對豐度分別是3.57%和2.05%，明顯高于干濕交替處理0.82%和0.07%。芽孢桿菌綱（Bacilli）下的Planococcaceae群落豐度差異主要表現在水稻分蘗期，干濕交替處理（10.91%）明顯高于淹水處理（0.61%）。酸桿菌綱（Acidobacteriia）下Koribacteraceae豐度差異表現在水稻成熟期，淹水處理（2.09%）高于干濕交替處理（1.19%）。芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）下的Gemmatimonadaceae群落在水稻分蘗期和成熟期豐度分別是0.02%和0.04%，均高于干濕交替處理的兩個時期（0.003%和0.005%）。

2.3 水分管理對土壤理化性質的影響

兩種水分管理措施對土壤pH、養分（有效N、P、S）和有效重金屬（CaCl2提取態Cd、Pb、Zn和Ni）的影響見圖4。從圖4看出，成熟期土壤pH顯著高于分蘗期（P＜0.05），但水分管理并沒有顯著影響土壤pH。在分蘗期和CF相比，IF處理顯著降低土壤有效N的含量（P＜0.05），而在成熟期CF和IF處理對土壤有效N含量的影響不顯著。無論是水稻分蘗期還是成熟期，IF處理均顯著增加了土壤有效P的含量（P＜0.05）。和有效N、P不同，成熟期土壤有效S的含量顯著高于分蘗期（P＜0.05），而兩種水分管理沒有顯著影響土壤有效S的含量。

圖2 水分管理對主要細菌群落綱分類單元（%）相對豐度的影響Figure 2 Effects of flooding regime on bacteria community relative（%）abundance at class taxa level

本研究用CaCl2浸提的重金屬含量代表土壤中重金屬的有效性。水分管理對CaCl2浸提的重金屬含量與水稻生長時期有很大的相關性。具體為：在水稻分蘗期和CF相比，IF處理顯著降低了CaCl2浸提的Cd、Pb、Zn、Ni的含量（P＜0.05）。而在成熟期，和CF處理相比，IF處理則顯著增加了CaCl2浸提的Cd、Pb和Zn的含量。此外，就CF處理而言，成熟期Cd、Pb、Zn、Ni的有效性顯著低于分蘗期（P＜0.05）。而IF處理，Cd、Pb、Zn、Ni的有效性在水稻生長不同時期沒有顯著變化。

2.4 細菌群落和土壤理化性質相關關系

圖3 不同水分條件下對細菌群落在科分類單元（%）相對豐度的組成Figure 3 Bacteria community structure at family taxa level（%）under different soil moisture

通過科分類單元相對豐度的細菌群落與土壤理化性質的相關性分析，結果如表4所示，Geobacterace-ae和Gemmatimonadaceae群落豐度和土壤有效P含量有顯著負相關性，Planococcaceae群落豐度和土壤有效P含量有顯著正相關性，說明土壤中P的有效性是影響該細菌群落的關鍵因素；此外，Enterobacteriaceae和Moraxellaceae群落豐度和土壤有效Cd、Pb、Zn和Ni含量均有顯著正相關性，與此同時，兩個細菌群落和土壤pH均呈顯著負相關性，和有效N含量呈現顯著正相關性。

圖4 水分管理對水稻兩個生育時期土壤理化性質的影響Figure 4 Effects of flooding regime on soil physical and chemical properties at rice two growth stages

表4 土壤性質與細菌群落豐度相關性分析Table 4 Correlation analysis between bacteria relative abundance and soil physiochemical properties

3 討論

本研究發現，水分管理對土壤理化性質的影響顯著。在水稻分蘗期，淹水處理土壤重金屬有效量（0.01 mol·L-1CaCl2浸提）明顯高于干濕交替處理，通過相關性分析發現，土壤有效硫含量與土壤有效Cd（r=-0.700，P＜0.05）、Pb（r=-0.600，P=0.051）、Zn（r=-0.827，P＜0.05）、Ni（r=-0.791，P＜0.05）含量有明顯負相關性，說明土壤有效硫的增加可以顯著抑制重金屬有效性[20]，這與前人研究的結果相一致。而在分蘗期，水分管理對土壤有效S含量影響差異不顯著，這表明水分條件通過S元素對重金屬的固定差異不顯著。此外，淹水環境提高土壤中地桿菌科（Geobacteraceae）群落豐度。地桿菌科是典型鐵還原細菌群落，且普遍存于鐵還原環境中[21-22]。在屬水平上，淹水土壤中，粘球菌科下的厭氧粘細菌屬（Anaeromyxo?bacter）和地桿菌科下地桿菌屬（Geobacter）的相對豐度1.86%和1.46%明顯高于干濕交替處理0.90%和0.23%，說明在水稻分蘗期，淹水土壤存在豐富的鐵還原功能的細菌群落[23-24]，表明長期淹水促進Fe（Ⅲ）化合物作為電子受體還原為Fe（Ⅱ）化合物[25]，導致土壤中含鐵礦物的溶解并釋放金屬元素到土壤溶液中[12，26-27]。大量 Fe（Ⅱ）離子釋放到土壤溶液中，與Cd2+等離子競爭土壤表面吸附位點，促進重金屬離子釋放進入土壤溶液[28]。到了成熟期，淹水處理土壤重金屬有效量明顯低于干濕交替處理，這是由于在植稻后期，Fe/Mn氧化物的還原溶解漸漸減弱，而重金屬硫化物的沉淀作用居主導所致。可以看出，長期淹水可以顯著降低土壤Cd、Zn、Pb、Ni有效量，這一結果已經有大量研究報道[3，29-30]。與此同時，我們還發現，在整個水稻生長期，干濕交替處理的土壤有效P含量顯著高于淹水處理。而早期的研究發現水分管理對土-砂聯合體系的有效P含量影響并不明顯[31]；但是孫國紅等[32]通過兩年農田紅壤土的盆栽試驗研究發現連續淹水有效P含量顯著高于干濕交替處理的土壤。這說明土壤中有效P的含量可能不僅與水分管理相關，還受到土壤類型影響。此外，土壤pH值是影響重金屬有效性的一個重要因素，普遍認為土壤pH值的升高能夠降低土壤重金屬（如：Cd、Zn、Pb、Ni等）的有效性，但是有研究發現：土壤中的P含量對于pH環境有強烈的干擾性，甚至有效Cd含量和pH值出現正相關[33]，這反映出土壤pH值改變并不一定會造成Cd形態的相應改變[34]，因此可以推知在本研究中不同水分條件下，土壤重金屬有效性的變化受到多因素的影響。

通過對細菌群落α多樣性（Chao1指數，Shannon指數和OTU）分析發現，在水稻分蘗期，菌群的豐度和多樣性受水分條件影響明顯，且種群豐富度變化差異顯著；到水稻成熟期，兩種水分管理下α多樣性指數接近。Foulquier等[35]通過調查野外濕地菌群結構發現，不同水分條件并不會顯著影響菌群多樣性和OTU豐富度。侯海軍等[36]關于田間水分管理對稻田細菌群落結構和豐富度影響的研究發現，不同水分條件對細菌群落多樣性影響差異不顯著。這說明土壤水分條件并不是影響細菌群落α多樣性差異的關鍵因素。土壤中重金屬污染程度與細菌群落的豐度和數量有密切關系。有研究報道，土壤重金屬（如Pb、Ni等）含量的增加可以提高土壤細菌數量和豐富度[37-38]，這與本研究觀察到的結果相一致。說明水稻分蘗期細菌群落α多樣性變動和土壤理化性質的差異性有關。

對于細菌群落結構和相對豐度的分析發現，細菌群落的OTU組成在水稻分蘗期受到水分條件影響差異明顯，而到成熟期菌群在兩種水分條件下OTU結構趨勢相近。這主要是來之γ變形菌綱和芽孢桿菌綱群落變化，與干濕交替處理相比，淹水處理下，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）和莫拉菌科（Moraxellaceae）相對豐度分別提高了4.37倍和30.7倍，這些菌群的豐度變化與土壤有效Cd、Zn、Pb、Ni含量和土壤pH、有效N含量均有顯著相關性。Gati在2017年發表的研究發現，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）群落含有多種轉運蛋白，對Zn2+毒性的濃度有耐受和體內平衡作用，并且通過ZntB蛋白轉運吸收[39]。本研究發現分蘗期淹水環境促進土壤中Zn2+的釋放，有助于腸桿菌科群落的新陳代謝活動，促進其相對豐度的顯著提高，而后期隨著Zn有效性的降低，群落豐度也隨著顯著降低。莫拉菌科（Moraxellaceae）與腸桿菌科群落的相對豐度變化相一致，但目前針對該群落對重金屬敏感性研究還鮮有報道，而莫拉菌科（Moraxellaceae）下不動桿菌屬（Acinetocter sp.）菌群，在早期研究也發現該群落對Ni，Pb，Zn的液態環境有耐受性[40-41]。而干濕交替處理下Planococcaceae群落相對豐度比淹水處理的提高了17.77倍，關于Planococcaceae群落研究少有報道，本研究發現土壤有效磷含量與該菌群豐度呈正相關。到水稻成熟期，主要的細菌群落結構差異來自δ變形菌綱（Deltaproteobacteria），在淹水環境下地桿菌科（Geobacteraceae）和粘球菌（Myxococcaceae）也比干濕交替處理的相對豐度提高7.27倍和2.48倍，其中土壤有效P含量是影響地桿菌科群落豐度的關鍵因子，這是因為磷酸鹽固定鐵離子為Fe3PO4化合物，降低地桿菌科菌群對Fe的利用性，進而降低該細菌群落的生物活性[42]。

4 結論

（1）長期淹水能夠顯著降低土壤有效Cd，Pb，Zn和Ni的含量，而干濕交替對其含量無顯著影響，且干濕交替能夠維持土壤較高的有效P含量。

（2）水分管理措施本身不會對根際細菌群落α多樣性造成顯著影響，而土壤理化性質的差異和水分條件的交互影響是造成細菌群落α多樣性變動的主要原因。

（3）在分蘗期腸桿菌科（Enterobacteriaceae）和莫拉菌科（Moraxellaceae）豐度變化主要受土壤重金屬有效性的影響，Planococcaceae群落變動受土壤有效P的影響；在水稻成熟期，地桿菌科（Geobacteraceae）主要是受到土壤P的有效性影響。