百草枯通過調節Rac1-ROS信號通路促進肺上皮細胞上皮間質轉化

王暉暉 凌冰玉 張繼燃 徐繼揚（通訊作者）

（江蘇省蘇北人民醫院急診科 江蘇 揚州 225001）

目前百草枯致肺纖維化的機制尚不明確，近年來研究表明肺泡上皮細胞可通過上皮間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）向肌成纖維細胞轉化[1]。研究證實EMT是肺纖維化發生發展的重要機制，而肺上皮細胞EMT的發生是肺纖維化形成的重要標志之一[2-3]。

Rac1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1）屬于小G蛋白超家族的重要成員之一，在多種細胞內具有調節肌動蛋白細胞骨架重組，導致細胞板狀偽足形成和膜褶皺樣運動，影響細胞形體極化，促進細胞運動與遷移，促進細胞內活性氧（Reactive oxygen species,ROS）產生等作用[4]。本課題組前期研究不同活性的Rac1質粒瞬時轉染肝上皮細胞，證明Rac1可促進EMT。但是Rac1在百草枯肺纖維化的EMT中的作用尚不清楚，本文將通過轉染不同活性的Rac1質粒到人肺上皮細胞HPAEpiC中，觀察其EMT的作用。

1.材料與方法

1.1 細胞與試劑

人肺上皮細胞株HPAEpiC購自美國ATCC；百草枯購于Sigma公司；DEME培養基、胎牛血清購于Gibco公司；MTT試劑盒購于Thermo Fisher公司；Vimentin抗體購于Merck&Millipore公司；α-SMA抗體購于Sigma公司；β-actin、CK-8、E-cadherin購于Bioworld公司；Lipofectamine2000購于Invitrogen公司；ROS試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 細胞培養

取人肺上皮HPAEpiC細胞，培養于含10%胎牛血清的DEME培養基中（37℃、5%CO2），待細胞融合至90%左右，用0.25%胰酶-EDTA 消化、傳代。

1.3 細胞轉染

從標準定義可以看出，t_source只是針對能夠響應從幀的源設備的要求，但是RPT并不在此范圍內。標準中關于RPT的性能要求描述詳見IEC 61375-3-1-2012中的5.3.1章節。其中，與本文所描述問題相關的標準中的第一條，從字面上理解為，RPT能夠識別數據幀的初始方向并能保持穩定時間T_ST=2.0 μs，即RPT在從A側向B側轉發數據幀結束后的2.0 μs時間內將無法轉發B側發來的數據幀。這正是本文中描述的列車通信故障所處的工況：主設備BA與從設備D3分別位于RPT的A、B兩側，中繼器從A側接受了主幀轉發到B側，然后又將B側發來的從幀轉發到A側。

將對數生長期的HPAEpiC細胞以每孔2×105個細胞接種于6孔細胞培養板，37℃培養過夜。根據Lipofectamine2000說明書操作步驟，將質粒轉入細胞內，4～6h后換成正常培養基。

1.4 MTT取4×103人肺上皮 HPAEpiC細胞接種于96孔板，24h細胞貼壁后，加入不同濃度的(200、100、50、20、10、5、0μmol/L)PQ溶液，每組設3個平行孔，培養72h后，各孔加入20μg的MTT溶液(0.5%)，37℃培養箱中孵育4h，再加入150μg二甲基亞砜(DMSO)，搖床10分鐘輕輕地混勻，酶聯儀上選擇檢測波長490nm比色測定各孔的吸光度(OD值)，計算IC50值。

1.5 細胞蛋白的檢測

采用 Western blotting法，取經過預處理的細胞，加PBS洗滌，加入RIPA裂解液冰上裂解30min，30min后4℃、12000r/m離心10min，取上清液于-20℃保存。各組蛋白等量加樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，200mA恒流轉至PDVF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗室溫孵育過夜，TBST洗滌3次，HRP標記的二抗室溫孵育2h，TBST洗滌3次，加ECL發光液化學發光顯色，壓片曝光。

1.6 細胞遷移能力檢測

采用Transwell小室實驗，轉染細胞4～6h，胰酶消化，調整各組細胞使其細胞數為1×104/ml。取各組細胞200μl加入各小室，下室加入500μl的10%FBS-DEME培養基，常規培養24h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，光鏡下隨機選取6個視野，在倒置顯微鏡拍照、計數，取平均值。

1.7 ROS的檢測

取按照上述分組培養的細胞，加入2’,7’-二氯二氫熒光素黃二乙酸酯（DCFH-DA）探針孵育30min后取細胞沉淀，PBS懸浮細胞，525mm的發射波長和488mm的激發波長檢測刺激后的熒光強度。計數1×104個細胞，以DCFH-DA（DCF）的平均熒光強度表示ROS的生成量。

1.8 統計學處理

2.結果

2.1 PQ對HPAEpiC細胞增殖影響

以不同濃度PQ孵育HPAEpiC細胞，在不同時間點收集細胞，使用MTT法檢測PQ對肺上皮細胞的增殖影響。如圖1A所示，PQ誘導肺上皮細胞死亡呈現劑量和時間依賴性關系，PQ抑制HPAEpiC細胞的IC50值為91.3μmol/L(圖1B)，結合IC50和生長曲線，我們確定50μmol/LPQ用于后續實驗。

圖1

2.2 Rac1促進間質表達，抑制上皮表達

與對照組細胞相比，空質粒、PQ組和野生型Rac1細胞CK8、E-cadherin表達減少，Vimentin、α-SMA表達增加（P均＜0.05，圖2）；與空質粒組、PQ組和野生型Rac1組比，持續激活型Rac1轉染細胞CK8、E-cadherin表達減少，Vimentin、α-SMA表達增加，而顯性負調控Rac1轉染細胞CK8、E-cadherin表達增加，Vimentin、α-SMA表達減少，以上差異具有統計學意義（P均＜0.05，圖2）。

圖2 各組細胞CK8、E-cadherin、Vimentin、α-SMA的表達情況

2.3 Rac1促進HPAEpiC細胞遷移 與對照組細胞相比，空質粒、PQ組和野生型Rac1細胞遷移能力增加（P均＜0.05，圖3）；與空質粒、PQ組、野生型Rac1轉染細胞比，持續激活型 Rac1轉染的HPAEpiC細胞遷移能力增加，而顯性負調控Rac1轉染細胞遷移能力減弱（P均＜0.05，圖3）。圖3各組細胞遷移能力的檢測

圖3

2.4 Rac1促進HPAEpiC細胞ROS的表達

與對照組細胞相比，空質粒、PQ組和野生型Rac1 細胞ROS表達明顯增高，（P均＜0.05，圖4）；與空質粒、PQ組和野生型Rac1轉染細胞比，持續激活型Rac1轉染細胞ROS表達較高，而顯性負調控Rac1轉染細胞ROS表達相對較低（P均＜0.05，圖4）。

圖4 各組細胞的ROS表達情況

3.討論

百草枯中毒后可引起多臟器損害，而肺臟是其重要的靶器官，引起不可逆的肺間質纖維化，治療效果差。因此研究百草枯致肺纖維化的機制成為了急診中毒領域的難點和重點。

EMT是具有極性的上皮細胞轉化成具有活動能力、能在細胞基質間自由移動的間質細胞的過程，其以上皮細胞極性的喪失和間質特性的獲得為特征。體內外研究發現百草枯通過調控β-catenin來誘導EMT的發生，進而促進肺纖維化的形成[5-6]；通過博萊霉素誘導的肺纖維化動物模型中，蔡琳等證實肺泡上皮細胞可以通過EMT向MFs轉化[7]。

大量研究表明，氧化應激與肺纖維化的關系密切，百草枯可通過氧化還原反應在細胞內產生過量ROS，從而引發肺及各臟器細胞膜脂質氧化應激損傷。研究顯示MMP3處理小鼠乳腺上皮細胞時，Rac1b可促進ROS的產生，而ROS可刺激轉錄因子Snail的表達和EMT的發生[8]。Rac1、ROS表達或活性的異常升高在肺纖維化過程中起著重要作用，但兩者的相互作用及具體機制尚不清楚。

我們研究證實，與陰性對照組相比，PQ可刺激人肺上皮細胞HPAEpiC，在抑制細胞增殖的同時，增加了遷移能力，同時促進ROS的產生。本實驗通過將不同Rac1活性的質粒轉染到肺上皮細胞中，證實 Rac1通過以下兩個方面影響HPAEpiC細胞 EMT：（1）細胞出現 EMT分子標志物的改變，即上皮標志物CK8、E-cad表達下調、間質標志物 Vimentin、α-SMA表達上調；（2）Tranwell 小室實驗證實細胞遷移能力增強。檢測不同Rac1活性的質粒轉染到肺上皮細胞后，Rac1可促進肺上皮細胞的ROS表達，表明Rac1-ROS在PQ致肺上皮細胞EMT的過程中起著關鍵的作用。基于以上研究，我們推測PQ通過激活Rac1-ROS信號通路來啟動EMT，從而使得HPAEpiC細胞的遷移能力增強，促進了肺纖維化的發展。

綜上所述，本研究通過將上調和下調Rac1活性的質粒轉染到HPAEpiC細胞，初步證實Rac1-ROS可促進PQ誘導的肺上皮細胞EMT。因此深入研究Rac1-ROS在PQ致肺纖維化過程中的作用及其具體機制具有重要意義，將為PQ肺纖維發生發展及靶向治療提供有價值的理論依據。