外源性褪黑素抑制急性胰腺炎大鼠腸黏膜上皮細胞凋亡

張繼燃 談定玉 王暉暉 凌冰玉 徐繼揚（通訊作者）

（江蘇省蘇北人民醫院急診科 江蘇 揚州 225001）

急性胰腺炎是急診常見疾病，其發病率高，病死率居高不下，20%～30%的患者臨床經過兇險，總體病死率為5%～10%[1]。其中，麻痹性腸梗阻、腸道屏障功能損害、腸道細菌易位，進而引起腸源性感染，與其病情加重，發生感染性休克、多器官功能衰竭并導致死亡密切相關。

腸黏膜上皮細胞是腸道屏障功能組成的一部分，其增殖與凋亡保持動態平衡在維持腸道屏障功能、保持腸黏膜上皮穩態方面有重要作用，而急性胰腺炎時會誘導腸黏膜上皮細胞凋亡增加，加重腸黏膜損傷。褪黑素是由松果體產生的一種吲哚類激素，有鎮靜催眠和調節睡眠覺醒周期的作用[2]。有研究顯示外源性褪黑素能夠通過抑制急性胰腺炎大鼠腸黏膜的損傷來減少腸道細菌易位，進而減少感染，降低死亡率[3]。而關于褪黑素是否能夠抑制腸黏膜上皮細胞凋亡的研究未有報道，本研究擬對著一問題進行初步探討，從而為進一步的實驗研究提供一定的研究方向，同時為急性胰腺炎的治療提供新的思路。

表 淀粉酶濃度、內毒素濃度以及細胞凋亡率各組對比

1.材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性SD大鼠（購置于揚州大學實驗動物中心）12只，重量250～300g，隨機分為對照組、實驗組和治療組（每組4只）。實驗組及治療組大鼠制備急性胰腺炎模型[4]，對照組大鼠胰腺被膜下均勻多點注射生理鹽水，治療組大鼠在誘導急性胰腺炎之前30min通過灌胃法向大鼠胃內侍以50mg/kg體重的褪黑素，對照組及實驗組大鼠通過相同方法侍以等量的生理鹽水。

1.2 實驗試劑

淀粉酶檢測試劑盒（南京鷺飛生物技術有限公司）；內毒素檢測試劑盒（上海樊克生物科技有限公司）；Tunel原位凋亡檢測試劑盒（南京鷺飛生物技術有限公司）。

1.3 實驗方法

實驗動物處理24小時后處死，取血備測血清淀粉酶濃度、血清內毒素濃度；分別取對照組、實驗組和治療組大鼠小腸及結腸中段處腸管1cm，制備石蠟切片，通過Tunel法進行腸黏膜細胞原位凋亡檢測。（具體實驗方法根據各試劑盒說明書指示進行）

2.結果

2.1 血清淀粉酶濃度

對照組、實驗組及治療組分別為655.70±151.87U/L、1315.90±217.58U/L、1086.08±149.14U/L，對照組和實驗組以及對照組和治療組間差異有統計學意義（P＜0.05），實驗組和治療組間差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.2 血清內毒素濃度

對照組、實驗組及治療組分別為45.92±4.16EU/L、130.48±6.52 EU/L、86.37±7.97 EU/L，任意兩組間對比，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

2.3 Tunel法進行原位凋亡檢測

DAB顯色后光鏡下觀察可見凋亡細胞的細胞核為棕褐色，呈固縮狀，實驗組較對照組及治療組凋亡細胞數量多（圖1）。計算細胞凋亡率，小腸黏膜對照組、實驗組及治療組細胞凋亡率分別為（14.05±2.13）%、（71.05±2.21）%、（32.97±3.15）%，結腸黏膜上皮細胞凋亡率分別為（15.73±6.58）%、（50.22±6.85）%、（42.96±7.72）%，對照組＜治療組＜實驗組，任意兩組間差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 Tunel法原位凋亡檢測（A1-4、B1-4、C1-4分別為小腸黏膜上皮細胞對照組、實驗組、治療組；D1-4、E1-4、F1-4分別為結腸黏膜上皮細胞對照組、實驗組、治療組）（×400倍）

3.結論

褪黑素主要是由哺乳動物和人類的松果體產生的一種激素，實驗研究表明，用褪黑素預處理可預防胰腺炎癥，減輕急性胰腺炎大鼠的胰腺組織損傷[5-6]。其對胰腺有保護性作用，能夠通過抗氧化，增強免疫防御，凋亡調控等作用防止胰腺炎的發生，減少胰腺損傷[7]。

細胞凋亡是基因的調控下發生的程序性死亡過程。腸黏膜上皮細胞的凋亡和增殖動態平衡在維持腸道屏障功能方面有重要作用，相關研究證實在急性胰腺炎時會發生腸黏膜上皮細胞凋亡增加，從而導致腸黏膜損傷、腸通透性增加，進而引起細菌易位、腸源性感染，最終導致多器官功能衰竭，甚至死亡[8]。現有的研究未有關于褪黑素對胰腺炎腸黏膜上皮細胞凋亡的影響。

在本研究中，通過建立急性胰腺炎大鼠模型，研究外源性褪黑素對急性胰腺炎大鼠腸黏膜上皮細胞凋亡的影響，結果顯示施加外源性褪黑素的治療組與未施加褪黑素的實驗組相比，腸黏膜上皮細胞凋亡減少，且其內毒素濃度也較實驗組減少。通過實驗結果，可知外源性褪黑素能夠通過減少急性胰腺炎大鼠腸黏膜上皮細胞凋亡，保護腸黏膜屏障功能。