白肉型油桃中油桃9號及其黃肉芽變的揮發(fā)性香氣物質(zhì)分析

朱運欽， 李慶偉， 曾文芳， 牛 良， 潘 磊， 蔡祖國，3， 魯振華， 崔國朝， 王志強

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南鄭州 450009； 2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南中牟 451450；3.河南科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

桃是重要的溫帶落葉果樹之一，在全世界廣泛種植，是深受人們喜愛的水果之一。特別是近年來，隨著桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，桃果實對人們?nèi)粘Ｉ畹挠绊懹鷣碛螅c此同時，消費者對桃果實品質(zhì)的要求也越來越高。香氣成分是桃果實重要的感官品質(zhì)之一，能夠影響人們對桃果實的喜好程度。目前在桃果實中已發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)性香氣成分有190多種，主要是呈青草型香味的醇類、醛類和花、果香型香味的酯類和內(nèi)酯類[1-3]，研究這些香氣成分及其變化能夠為培育適合人們口感的桃品種奠定理論基礎(chǔ)，因而具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

中油桃9號是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所通過雜交育種方法培育出的一個白肉型油桃優(yōu)良品種，其突變體是一個自然的黃肉型芽變。桃果肉的黃色與白色是由果肉中的類胡蘿卜素積累決定的[4-7]，黃肉桃中的類胡蘿卜素剪接加雙氧酶基因(CCD4)發(fā)生了突變而失去活性，不能降解類胡蘿卜素，而白肉桃中的CCD4則隨著果實的發(fā)育不斷降解類胡蘿卜素，從而使兩者的果肉顏色發(fā)生巨大變化[8-9]。CCD4酶能夠催化多種類胡蘿卜素裂解成為復(fù)雜的脫輔基類胡蘿卜素，進一步形成揮發(fā)性有機化合物(volatile organic compounds，簡稱VOC)[6，10-12]，因此，在桃果實由白肉突變?yōu)辄S肉的同時，可能會引起揮發(fā)性香氣成分的變化。

筆者所在課題組已經(jīng)對中油桃9號及其突變體果實中的類胡蘿卜素積累和CCD4基因的表達進行了檢測和分析，證實了這2個材料在類胡蘿卜素積累和CCD4的表達方面存在極顯著差異[13]，為了進一步弄清中油桃9號由白肉桃突變?yōu)辄S肉桃時，是否引起了其香氣成分的變化，筆者對中油桃9號及其黃肉突變體的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行了分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所的桃育種圃，中油桃9號和黃肉突變體高接在同一株2個主枝的桃樹上，共4株，取樣前高接后時間已達5年，田間管理一致，2個主枝的生長勢及結(jié)果量基本一致。

1.2 試驗方法

2015年于盛花后25、35、45、55和65 d從樹上選取有代表性的果實，立即帶回實驗室并去掉果皮，將果肉切成直徑小于0.5 cm的碎薄片，迅速用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩７Q取10.0 g果肉，切碎后迅速裝入15 mL樣品瓶內(nèi)，加入4.0 g氯化鈉，攪勻，上部留約2 cm空間，加蓋封口，40 ℃ 水浴預(yù)熱15 min，40 ℃恒溫吸附30 min，最后于250 ℃解析3 min，進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)檢測分析。

檢測儀器為美國生產(chǎn)的Agilent 7890A -5975C GC-MS聯(lián)用分析儀，萃取頭由美國Supelco公司生產(chǎn)[65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)吸附劑]。在檢測前先進行萃取頭老化處理，初次使用時將萃取頭在氣相色譜進樣口于250 ℃老化2 h，載氣為氦氣，流速為1 mL/min，后續(xù)使用老化時間為5 min。色譜條件和質(zhì)譜條件參照羅靜等的方法[14]。每個樣品重復(fù)測定3次。

揮發(fā)性化合物經(jīng)過分離后形成的色譜峰經(jīng)計算機圖譜庫(NIST和Wiley)檢索，結(jié)合人工譜圖解析定性，選擇匹配度大于800的化合物予以定性確認，并按照面積歸一化法計算各組分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 中油桃9號與突變體香氣化合物的種類和含量分析

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀，對不同時期中油桃9號和突變體果實的香氣成分進行檢測定性。由表1可知，經(jīng)人工解析分析，在5個時期的果實中共檢測出揮發(fā)性香氣化合物78種，其中醛類16種、醇類12種、酯類15種、酮類10種、內(nèi)酯類10種、烷烴類6種、萜烯類6種、酚類3種，各時期樣品被檢出并定性的總香氣化合物相對含量在91.94%～99.18%之間。

盛花后25 d，在中油桃9號果實中共檢測到27種揮發(fā)性香氣化合物，主要是反-2-己烯醛(52.56%)、苯甲醛(26.79%)和正己醛(12.21%)；在突變體中共檢測到30種香氣物質(zhì)，主要是苯甲醛(47.67%)、反-2-己烯醛(29.39%)和正己醛(12.68%)。兩者共有的香氣成分有17種。中油桃9號的特有香氣成分有10種，其中最主要的是 順-2-己烯-1-醇(2.44%)；突變體的特有香氣成分有13種，其中最主要的是反-2-己烯-1-醇(2.07%)。此時期2個材料的主要香氣成分相同，特有香氣成分相近。

盛花后35 d，在中油桃9號果實中共檢測到28種揮發(fā)性香氣化合物，主要是反-2-己烯醛(35.57%)、正己醛(23.72%)和2-己烯醛(14.97%)。在突變體果實中共檢測到32種揮發(fā)性香氣化合物，主要是反-2-己烯醛(41.88%)、正己醛(24.90%)、2-己烯醛(6.21%)和苯甲醛(4.02%)。兩者共有的香氣成分有19種。中油桃9號的特有香氣成分有9種，依次是醇類、酮類、萜烯類、烷烴類、內(nèi)酯類和酚類；突變體的特有香氣成分有13種，主要是酮類和醇類，其次是烷烴類、醛類、酯類、內(nèi)酯類和酚類。此時期2個材料的主要香氣成分相近，特有的香氣成分差別不大。

盛花后45 d，在中油桃9號果實中共檢測到19種揮發(fā)性香氣化合物，主要是反-2-己烯醛(90.48%)，其次是苯甲醛(3.55%)。在突變體果實中共檢測到22種香氣化合物，主要是反-2-己烯醛(74.59%)、正己醛(11.44%)和苯甲醛(6.11%)。兩者共有的香氣成分有13種。中油桃9號的特有香氣物質(zhì)有6種，分別是醛類、酯類、烷烴類和酮類；突變體的特有香氣成分有9種，主要是醛類，其次是酯類、萜烯類和醇類。此時期2個材料的主要香氣成分近似，特有香氣成分差別較大。

盛花后55 d，在中油桃9號果實中共檢測到17種揮發(fā)性香氣化合物，主要是反-2-己烯醛(93.31%)，其次是苯甲醛(1.81%)。在突變體果實中共檢測到19種香氣化合物，主要是反-2-己烯醛(69.17%)，其次是正己醛(25.80%)。兩者共有的香氣成分有12種。中油桃9號的特有香氣物質(zhì)有5種，分別是醇類、內(nèi)酯類、醛類和酮類；突變體的特有香氣成分有7種，主要是醛類，其次是極少量的醇類和酯類。此時期2個材料的香氣成分都以反-2-己烯醛為主，但特有香氣成分存在很大差異。

花后65 d(果實成熟期)，在中油桃9號果實中共檢測到21種揮發(fā)性香氣化合物，主要是2-己烯醛(61.14%)、正己醛(23.57%)和反-2-己烯醛(6.84%)。在突變體果實中共檢測到23種香氣化合物，主要是反-2-己烯醛(70.96%)和正己醛(18.83%)。兩者共有的香氣成分有14種，主要是正己醛和反-2-己烯醛。中油桃9號的特有香氣物質(zhì)有7種，主要是酚類和萜烯類，其次是酯類、醇類和烷烴類；突變體的特有香氣物質(zhì)有9種，主要是醇類，其次是醛類、酮類和內(nèi)酯類。此時期兩者的主要香氣成分相似，但是中油桃9號特有的香氣成分主要為酚類和萜烯類，而突變體則主要為醇類。

上述分析表明，自幼果期至果實成熟期，中油桃9號與其突變體之間主要的香氣物質(zhì)種類均相同或相似，但兩者特有香氣成分的差異隨果實發(fā)育逐漸變大。在各時期中，突變體的揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類均比中油桃9號多，這可能與其類胡蘿卜素種類比中油桃9號多有關(guān)[13]。

表1 揮發(fā)性香氣化合物的種類和相對含量 %

續(xù)表1

揮發(fā)性香氣化合物中油桃9號突變體S1S2S3S4S5S1S2S3S4S5醛類 苯甲醛26.794.203.551.810.6047.674.026.110.900.30 4-甲基-3-戊烯醛—————————0.11醇類 1-辛炔-3-醇————————0.08— 順-2-甲基環(huán)己醇————0.07————— 順-2-己烯-1-醇2.440.91———————0.47 反-2-己烯-1-醇—————2.072.01——— 2-己炔-1-醇—0.38———————0.93 2-乙基己醇0.050.220.080.200.27—0.560.050.100.35 芳樟醇——————0.40——— 4-乙基環(huán)己醇0.15————————— 四氫吡喃-2-甲醇———0.17—0.03—0.17—0.22 反-2-甲基環(huán)戊醇————————0.040.05 環(huán)葵醇————————0.05— 反-1,2-環(huán)戊二醇————0.11—————酯類 順-2-己烯-1-醇乙酸酯1.190.98———2.370.46——— 反-2-己烯-1-醇乙酸酯———————0.18—— 順-3-己烯-1-醇乙酸酯0.393.81———0.571.99——— 反-3-己烯-1-醇乙酸酯———0.300.240.01—0.110.050.40 乙酸己酯0.061.53———0.140.37——— 反-2-己烯異戊酸酯0.15————————— 反-2-己烯-丙酸酯—————0.02———— 反-2-己烯-丁酸酯0.16————0.35———— 戊酸葉醇酯—————0.20———— 順式-3-乙烯醇-2-甲基-—————0.03———— 2-丁烯酸酯 鄰苯二甲酸二異丁酯—0.401.680.830.400.161.370.420.171.14 鄰苯二甲酸丁基異己酯0.32————————— 鄰苯二甲酸正丁異辛酯0.050.080.03—0.110.040.030.080.04— 酞酸二丁酯——0.23———0.20——— 異戊酸香葉酯—————0.02————酮類 1-戊烯-3-酮0.20————0.20———— 6-甲基庚烯酮——0.06———0.30——0.13 1-辛烯-3-酮0.08—0.08——0.09———— 6-(羥-苯-甲基)-2,2-——————2.23——— 二甲基-環(huán)己酮 茉莉酮—————0.02———— β-二氫紫羅蘭酮—0.44———————— 2,2二甲基環(huán)己基甲基酮——0.07————0.03—— 反式-香葉基丙酮——————0.15——0.09 順式-香葉基丙酮———0.07—————— 4-異丙烯基環(huán)己酮—0.35————————內(nèi)酯類 丁位(δ-)癸內(nèi)酯—1.56————0.22——— 丙位(γ-)己內(nèi)酯—0.48——0.24—0.71——0.35 丙位(γ-)辛內(nèi)酯—0.11————0.08——— 丙位(γ-)癸內(nèi)酯—3.230.080.110.23—0.650.040.080.19 丙位(γ-)十二內(nèi)酯0.010.06———————— 丁位(δ-)十一內(nèi)酯——————0.04——— γ-十一內(nèi)酯(桃醛)——————0.09——— 5-乙基呋喃酮內(nèi)酯——0.150.15———0.41—0.21 6-戊基-2H-吡喃-2-酮—0.49————0.04———

續(xù)表1

揮發(fā)性香氣化合物中油桃9號突變體S1S2S3S4S5S1S2S3S4S5 順-四氫-6-(2-戊烯基)-—0.29————0.12——— 2H-吡喃-2-酮烷烴類 十三烷——————0.48——— 十二烷0.05—————0.61——— 2,6,10-三甲基十二烷0.030.51——0.04————— 十四烷—0.20————0.13——— 2,6,10-三甲基十四烷0.020.070.06—0.140.050.190.02—0.08 萘——0.16——0.120.27———萜烯類— 2,6,10,10-四甲基-1-氧雜螺—0.14———————— [4.5]癸-6-烯 π-律草烯—————0.09———— 苯并環(huán)庚三烯—————0.03—0.03—— 1-亞甲基-1H-茚0.170.38—0.130.27——0.190.13— 7-十四碳烯————0.08————— 雪松烯—————0.02————酚類 2,4-二叔丁基苯酚——————0.07——— 3,5-二叔丁基苯酚—0.06———————— 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚————1.73—————總和98.6596.7498.0098.6699.1897.7491.9498.4498.5397.72

注：S1、S2、S3、S4、S5分別表示盛花后25、35、45、55、65 d；“—”表示未檢測到該物質(zhì)。

2.2 中油桃9號與突變體香氣化合物類別的分析

醛類化合物是中油桃9號和突變體的主要香氣物質(zhì)，2個材料間的含量相近，且在5個時期中的變化不大(圖1-A)。醇類物質(zhì)的變化在2個材料間具有明顯差異(圖1-B)，在花后25、45、55 d時兩者比較接近，花后55 d之后在突變體中的含量快速上升，而在中油桃9號中的含量則基本無變化。酯類(圖1-C)、酮類(圖1-D)、內(nèi)酯類(圖1-E)和烷烴類(圖1-F)化合物在兩者間的變化趨勢相似，花后35 d時2個材料間的含量差別較大，中油桃9號的酯類、內(nèi)酯類含量明顯高于突變體，而酮類和烷烴類含量則明顯低于突變體，在其他幾個時期兩者比較接近。萜烯類化合物含量的變化在2個材料間差別較大(圖1-G)，中油桃9號在花后35、65 d的含量遠高于突變體。2個材料的酚類物質(zhì)含量在前4個時期很接近(圖1-H)，但在果實成熟時出現(xiàn)了很大差異，中油桃9號的含量為1.73%，而突變體果實中則未檢測到該類化合物。因此，從香氣成分的化合物類別看，果實成熟時兩者的差異主要在于醇類、萜烯類和酚類物質(zhì)。

3 討論

水果中的香氣成分大約有2 000種[2]，不同種類的水果具有不同的特征香氣，揮發(fā)性芳香物質(zhì)的比例及組合決定了水果的特有香味[15]。桃果實中的香氣物質(zhì)共有190多種[1]，對桃風味有重要影響的物質(zhì)主要有C6醛類和醇類、酮類、萜類、酚類、酯類和內(nèi)酯類等[6，16-20]。C6醛和醇屬于青草香型香氣物質(zhì)，酯和內(nèi)酯屬于果香型香氣物質(zhì)，萜類和酮類是桃最主要的“花香型”香氣物質(zhì)[19，21]。一些研究者認為，C6醛和C6醇是未成熟桃和油桃的主要呈味物質(zhì)[2，20，22]。桃果實中的醛和醇主要是反-2-己烯醛、反-2-己烯醇、順-3-己烯醛和苯甲醛，這些物質(zhì)是主要的“青草香型”香氣成分[23]。酯類主要有乙酸乙酯、乙酸己酯和乙酸己烯酯[3]。內(nèi)酯類主要以C6～C12偶數(shù)碳原子的γ-和δ-內(nèi)酯的形式存在，它使果實呈現(xiàn)桃味[3，17，21，23-25]。萜烯類主要以芳樟醇為代表，在油桃中的含量較高[22-23]。酮類主要有(E)-β-大馬酮、β-紫羅蘭酮等[2，23，26]。Wang等通過對50個桃品種的調(diào)查認為[3]，中國野生桃含有較高含量的萜類、酯類物質(zhì)，而起源于美國和歐洲的品種則含有較高含量的芳樟醇。本試驗從中油桃9號及其突變體果實中檢測到的香氣成分主要含有C6醛和醇類，其他揮發(fā)性化合物的含量都比較低，與一些報道基本一致[6，16-20]。

前人研究表明，不同桃品種的香氣成分存在較大差別[6，15-19]。Zhang等認為，γ-癸內(nèi)酯和δ-葵內(nèi)酯是Hujingmilu(白肉)桃果實的代表性香氣化合物[25]，但本研究的中油桃9號及其突變體果實成熟時分別以2-己烯醛、反-2己烯醛為主，γ-癸內(nèi)酯、δ-葵內(nèi)酯含量都很低或檢測不到，Aubert等也有類似的報道[27]。也有一些研究認為，芳樟醇在油桃中比較多[22-23]，但本研究在中油桃9號及其突變體的成熟果實中均未檢測到芳樟醇。Robertson等認為，白肉桃果實中的己醛、反-2-己烯醛、芳樟醇、γ-癸內(nèi)酯和δ-癸內(nèi)酯含量顯著高于黃肉桃[28]，但Wang等通過對95個桃和油桃品種的調(diào)查發(fā)現(xiàn)[29]，芳樟醇在白肉桃與黃肉桃間無顯著差異，認為香氣物質(zhì)的組成和含量與品種來源和品種特性有關(guān)，白肉蟠桃的香氣物質(zhì)總量和酯類含量高于其他品種，白肉蟠桃中的萜類物質(zhì)含量顯著高于白肉油桃，本研究中2個材料的醛類物質(zhì)含量無明顯差異，但萜烯類、醇類和酚類含量存在較大差異。

隨著桃果實的發(fā)育，香氣成分也在不斷發(fā)生變化。一些研究報道，醛類和醇類是未成熟果實的主要揮發(fā)性物質(zhì)，芳樟醇的含量隨著桃果實的成熟而顯著增加[15，26]，在果實成熟時，內(nèi)酯類尤其是γ-、δ-葵內(nèi)酯成為主要的香氣物質(zhì)，使果實呈現(xiàn)“桃味”[16，23，25]。然而本試驗中醛類物質(zhì)一直是中油桃9號和突變體在各發(fā)育期的主要香氣成分，果實成熟時在2個材料中只檢測到了較低量的γ-葵內(nèi)酯，沒有發(fā)現(xiàn)δ-葵內(nèi)酯，席萬鵬等也有相似的報道[22，27]。

從香氣物質(zhì)的來源看，它們主要通過脂肪酸途徑、異戊二烯途徑和氨基酸途徑合成。脂肪酸途徑是桃果實揮發(fā)性香氣物質(zhì)合成的最主要途徑，通過該途徑中的脂氧合酶(LOX)和酰基轉(zhuǎn)移酶(AAT)的作用，可形成醇、醛、酯、酮和內(nèi)酯[2，11，23]。氨基酸途徑是芳香族香氣物質(zhì)的合成途徑，其中的甘氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等是酯類合成的前體物質(zhì)，這些氨基酸在氨基轉(zhuǎn)移酶(ATF)和丙酮酸脫羧酶(PDC)等的作用下，形成支鏈醇、酸和酯類物質(zhì)，對桃果實風味物質(zhì)的組成影響較大[23]。異戊二烯途徑是形成桃果實花香型香氣物質(zhì)的主要途徑，通過該途徑可合成類胡蘿卜素，進而在類胡蘿卜素剪接加雙氧酶(CCD)的作用下，合成芳樟醇、萜烯醇、萜品烯等萜類和β-紫羅蘭酮等C13-脫輔基類胡蘿卜素類香氣物質(zhì)[6-7，11，23，30-31]。CCD4酶定位于質(zhì)體，能夠特異性裂解類胡蘿卜素，形成C13-脫輔基類胡蘿卜素[6]，為萜烯類化合物的合成創(chuàng)造底物[31]，再經(jīng)過復(fù)雜的化學(xué)過程形成各種揮發(fā)性有機化合物[6，10-11]。一些研究認為，在白肉桃內(nèi)CCD4的轉(zhuǎn)錄豐度與類胡蘿卜素起源的揮發(fā)性化合物有關(guān)[6-7]，證實了桃果實揮發(fā)性香氣物質(zhì)的形成和類胡蘿卜素的降解相關(guān)。CCD1酶涉及β-紫羅酮的合成[6，11]，在番茄果實中CCD1酶剪接類胡蘿卜素產(chǎn)生橙花醛、香葉醛和金合歡基丙酮等[30]。另外，還有一些研究者認為，香氣物質(zhì)的合成受乙烯的調(diào)控[23，25]。

中油桃9號與其黃肉突變體在類胡蘿卜素的含量及組成方面存在極顯著差異[13]，雖然中油桃9號的類胡蘿卜素含量隨著果實的發(fā)育不斷下降，但在果實發(fā)育的中后期合成類胡蘿卜的關(guān)鍵基因PSY、PDS、ZDS和LCY-B的表達量均高于突變體，同時CCD4基因的表達量也是隨著果實的發(fā)育而不斷上升的[13]，表明白肉桃果實合成的類胡蘿卜素不斷被CCD4酶降解，可能形成了各種揮發(fā)性香氣化合物。

中油桃9號與其突變體的醛類物質(zhì)含量在各個時期都很接近，這與類胡蘿卜素積累和CCD4基因的表達模式不一致[13]，進一步證實了醛類物質(zhì)的主要來源途徑不是類胡蘿卜素的降解，已有一些類似的報道[2，11，23]。花后55 d，中油桃9號的萜烯類和酚類化合物含量快速上升，而突變體中的這2種物質(zhì)含量則不斷下降或無明顯變化，這與CCD4基因在中油桃9號果實中的表達量快速上升一致[13]，因而認為，該基因的上調(diào)表達導(dǎo)致β-胡蘿卜素大量降解并進一步形成上述揮發(fā)性香氣化合物，Brandi等在白肉的Redheaven果實中也觀察到了相似的現(xiàn)象[6]。

綜上，本研究認為，中油桃9號與其黃肉突變體果實香氣物質(zhì)的差異主要在于萜烯類、酚類和醇類物質(zhì)，萜烯類和酚類物質(zhì)的形成與類胡蘿卜素的降解有關(guān)。