氯化鉀和氯化銨對葛仙米的生理影響

劉樹文， 楊川黔

(貴州師范學院化學與生命科學學院，貴州貴陽 550018)

葛仙米(NostocsphaeroidesKützing.)生長于水稻田中，別稱“天仙米”“天仙菜”“田木耳”，是一種藥、食兩用固氮藍藻。《本草綱目》記載，自東晉開始，葛仙米就被作為一種美食和中草藥成分，至今已有1 500多年的歷史[1]。其蛋白質含量較高，含有豐富的人體必需的各種氨基酸、脂肪酸、維生素以及礦質元素，并且含有具有多種藥用價值的各種多糖、色素等，還含有超氧化物歧化酶等生理活性物質[2-3]。據《本草綱目》《全國中草藥匯編》以及《本草綱目拾遺》等記載，葛仙米性寒、味淡，具有明目益氣、解熱清膈、消除疲勞、久食延年，能治療目赤紅腫、夜盲癥、脫肛、燙傷，兼具美容護膚之功效，具有很高的藥用和保健價值[4]。葛仙米在保健食品、食品添加劑、動物飼料、醫藥、美容以及精細化加工品等領域也具有廣闊的開發應用前景[4-5]。

葛仙米作為我國傳統出口的珍貴產品，同時在國內市場也占有舉足輕重的地位。葛仙米市場供不應求，價格昂貴，只有少數人能品嘗到這種珍稀的食用藍藻[6]。野生葛仙米在世界范圍內分布稀少，主要分布在我國湖北省鶴峰縣走馬鎮周圍的水稻田中，非洲有少量分布，也曾在陜西、湖北、廣西、廣東等省(區)有發現[1]。葛仙米的生長期為每年的11月份到第二年的5月份[1，7]。野生葛仙米產量甚微，大概每年 7.5 kg/hm2左右[7]。湖北省鶴峰縣適于葛仙米生長的水稻田有 796 hm2，但最大年產量已由25年前的25 t銳減至0.5 t[1]。為了保護野生葛仙米資源并使其得到合理的開發利用，關于葛仙米的生理生態學以及野生葛仙米的人工培養方面的研究引起了學者的廣泛關注[7]。陳珍研究了除草劑、殺蟲劑等農藥對葛仙米的毒害效應，農藥的使用已被認為是葛仙米減產的重要原因之一[7]。

NH4Cl和KCl是水稻田中廣泛施用的2種含氯氮肥和鉀肥。李云廣等研究了高濃度的NaCl對葛仙米生理生化特性的影響[8]。陳珍等研究表明1 mmol/L NH4Cl抑制了葛仙米的光合作用和呼吸作用速率[7，9]。本試驗將比較研究 1 mmol/L NH4Cl和1 mmol/L KCl 2種含氯化肥對葛仙米的生理生化特性的影響，為野生葛仙米資源的生態保護提供理論依據，為葛仙米保護區稻田的合理施肥提供指導。

1 材料與方法

1.1 葛仙米的培養

葛仙米采自貴州省岑鞏縣凱本鄉沈家灣村的水稻田中，在實驗室內制作得到人工培養的無雜藻和雜菌的葛仙米藻種。配制BG110培養基，121 ℃滅菌30 min。藻種經過勻漿之后，分別接種到9個經高壓滅菌的500 mL錐形瓶中，加入 450 mL BG110培養基。分成3組，每組3個重復。1組用BG110培養基、1組用含1 mmol/L KCl的BG110培養基、1組用含1 mmol/L NH4Cl的BG110培養基培養葛仙米。培養溫度為25 ℃，用30 W日光燈提供光照，光照度通過照度計測定，培養光照度為1 500 lx。用空氣泵通入用0.22 μm濾膜過濾的無菌空氣，通氣量為300 mL/min，經過8 d光照培養，取藻樣測定各項生理指標。

1.2 比生長速率的測定

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養液中培養8 d，分別培養0、2、4、6、8 d后，從9個錐形瓶中各取藻液10 mL，離心30 min，去上清液，加3 mL 95%乙醇，振蕩，放入4 ℃冰箱中24 h。4 000 r/min離心30 min后，取上清液，用分光光度計測定D665 nm和D649 nm。

葉綠素a(chlorophyll a，簡稱Chl a)含量計算公式[10]：

Chla(mg/L)=13.95×D665 nm-6.88×D649 nm。

(1)

比生長速率的計算公式[7]：

μ=(lnX1-lnX2)/(T2-T1)。

(2)

式中：X1、X2分別是T1(0 d)、T2(8 d)的葉綠素a含量。

1.3 各種光合色素含量的測定

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養液中培養6 d，分別從9個培養瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，去上清液，加3 mL 95%乙醇，4 ℃冰箱中放置24 h后 4 000 r/min 離心30 min，取上清液，用分光光度計在波長665、649、470 nm下測定吸光度D[16]。葉綠素b和類胡蘿卜素(carotenoid，簡稱Car)含量依據下列公式計算：

Chlb(mg/L)=24.96×D649 nm-7.32×D665 nm；

(3)

Car(mg/L)=1 000×D470 nm-2.05×Chla-114.8×Chlb。

(4)

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養液中培養6 d，分別從9個培養瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，去上清液，加入4 mL 0.1 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次后4 000 r/min離心30 min。取上清液，用分光光度計測定上清液在波長562、615、652 nm下測定吸光度D。再計算出藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱PC)、別藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱PE)的含量。根據Siegelman & Kycia計算[11]：

PC(mg/mL)=(D615 nm-0.474×D652 nm)/5.34；

(5)

APC(mg/mL)=(D652 nm-0.208×D615 nm)/5.09；

(6)

PE(mg/mL)=(D562 nm-2.41×PC-0.849×APC)/9.62。

(7)

1.4 蛋白質含量的測定(考馬斯亮藍G-250染色法[10])

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養液中培養6 d，從9個培養瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，去上清液，加4 mL 0.1 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min。提取得到的葛仙米蛋白溶液通過考馬斯亮藍G-250法測定。

1.5 可溶性糖含量的測定(蒽酮法[10])

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養液中培養6 d，從9個培養瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，去上清液，加4 mL蒸餾水，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min。提取得到的葛仙米可溶性糖溶液通過蒽酮法測定。

1.6 丙二醛含量的測定(硫代巴比妥酸法)

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養液中培養6 d，從9個培養瓶中各取藻液20 mL，4 000 r/min離心30 min，去上清液，加5% TCA 5 mL，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min后，分別取上清液2 mL放入相應帶蓋的試管中，再向每支試管中加0.67% TBA 2 mL，混合后沸水浴30 min，冷卻后 4 000 r/min 離心30 min后，取上清液，用分光光度計在波長450、532、600 nm下測定吸光度D，按公式C(μmol/L)=6.45(D532 nm-D600 nm)-0.56D450 nm計算出MDA濃度。樣品MDA含量(μmol/mg葉綠素)=C(μmol/L)×5/20/葉綠素濃度(mg/L)。

1.7 統計分析

利用軟件STATISTICA?7.0(StatSoft Inc，Tulsa，OK，USA)進行統計分析處理。單因素方差分析(ANOVA)和Tukey’s顯著性檢驗(HSD)用來檢測不同處理間的顯著性水平。正態分布和方差同質性分析分別根據Lilliefors檢驗和Levene檢驗。

2 結果與分析

2.1 KCl和NH4Cl對葛仙米生長的影響

BG110培養基、含1 mmol/L KCl的BG110培養基以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG110培養基3種培養條件下培養葛仙米的生長曲線見圖1。葛仙米分別在BG110培養基、含1 mmol/L KCl的BG110培養基中培養8 d后，以葉綠素含量表示的生物量分別增加到0 d的4.34、3.95倍；而在含1 mmol/L NH4Cl的BG110培養基中培養8 d后葛仙米的生物量降低到0 d的0.31倍。4 d以后1 mmol/L NH4Cl對葛仙米的生長有明顯的抑制作用，而1 mmol/L KCl對葛仙米的生長沒有明顯影響。

葛仙米分別在用BG110培養基、含1 mmol/L KCl的BG110培養基、含1 mmol/L NH4Cl的BG110培養基培養8 d后葛仙米的比生長速率見表1。在1 mmol/L KCl的BG110培養基中培養的葛仙米的比生長速率略低于BG110培養下葛仙米的比生長速率，但兩者之間無顯著差異(P>0.05)。但1 mmol/L NH4Cl的BG110培養基中生長的葛仙米的比生長速率為負值，與BG110培養基中培養的葛仙米的比生長速率相比降低了168.4%(P<0.05)。

表1 3種培養條件下培養8 d后葛仙米的比生長速率

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著。下表同。

2.2 KCl和NH4Cl對葛仙米光合色素含量的影響

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養液中培養6 d后，葛仙米的3種藻膽蛋白(藻藍蛋白、別藻藍蛋白、藻紅蛋白)含量見表2。與BG110培養基中培養葛仙米相比，1 mmol/L KCl的BG110培養基中培養葛仙米的藻藍蛋白、別藻藍蛋白、藻紅蛋白3種藻膽蛋白分別降低了23.7%、16.1%和21.5%，但無顯著差異(P>0.05)；1 mmol/L NH4Cl的BG110培養基中培養葛仙米的藻藍蛋白、別藻藍蛋白、藻紅蛋白3種藻膽蛋白分別降低了71.6%、74.6%和71.1%，且有顯著差異(P<0.05)。

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養液中培養6 d后，葛仙米的葉綠素a、類胡蘿卜素2種光合色素含量見表3。與BG110培養基中培養葛仙米相比，1 mmol/L KCl的BG110培養基中培養葛仙米的藻藍蛋白、別藻藍蛋白、藻紅蛋白3種藻膽蛋白分別降低了3.4%、5.8%，但無顯著差異(P>0.05)；1 mmol/L NH4Cl的BG110培養基中培養葛仙米的藻藍蛋白、別藻藍蛋白、藻紅蛋白3種藻膽蛋白分別降低了72.2%、52.8%，且有顯著差異(P<0.05)。

2.3 KCl和NH4Cl對葛仙米可溶性蛋白質含量的影響

由圖2可見，溶液中可溶性蛋白質含量(y)與考馬斯亮藍染色后的可溶性蛋白質溶液在595 nm波長下的吸光度(x)之間的直線方程為：y=0.002x+0.006(r2=0.997)。葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養液中培養6 d后，葛仙米的可溶性蛋白質含量見圖3。與BG110培養基中培養葛仙米相比，1 mmol/L KCl的BG110培養基、1 mmol/L NH4Cl的BG110培養基中培養葛仙米的可溶性蛋白質含量分別降低了 5.7%(P>0.05)和53.0%(P<0.05)。

表2 3種培養條件下培養6 d后葛仙米3種藻膽蛋白含量

表3 3種培養條件下培養6 d后葛仙米葉綠素a和類胡蘿卜素含量

2.4 KCl和NH4Cl對葛仙米可溶性糖含量的影響

根據圖4，溶液中可溶性糖含量(y)與蒽酮試劑染色后的可溶性糖溶液在620 nm波長下的吸光度(x)之間的直線方程為：y=1.511 6x-0.022(r2=0.997)。葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養液中培養6 d后，葛仙米的可溶性糖含量見圖5。與BG110培養基中培養葛仙米相比， 1 mmol/L KCl的BG110培養基、1 mmol/L NH4Cl的BG110培養基中培養葛仙米的可溶性糖含量分別降低了3.9%(P>0.05)和45.7%(P<0.05)。

2.5 KCl和NH4Cl對葛仙米丙二醛含量的影響

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養液中培養6 d后，葛仙米的丙二醛含量見圖6。BG110培養基、含1 mmol/L KCl的BG110培養基中培養葛仙米的丙二醛含量較低，且兩者之間無顯著差異(P>0.05)。含1 mmol/L NH4Cl的BG110培養基培養下葛仙米的丙二醛含量大幅度升高，分別升高到前兩者的21.7、22.0倍(P<0.05)。

3 結論與討論

本試驗比較研究了1 mmol/L KCl和NH4Cl 2種含氯化肥對葛仙米生理生化特性的影響。添加1 mmol/L NH4Cl的BG110培養基中培養的葛仙米，以葉綠素a含量表示的生物量、比生長速率以及各種光合色素、可溶性糖和可溶性蛋白質的含量大幅度下降(P<0.05)；添加1 mmol/L KCl的BG110培養基中培養的葛仙米，上述各項生理指標略微降低但無顯著差異(P>0.05)。因此，1 mmol/L NH4+對葛仙米生理生化特性的影響較為強烈，而 1 mmol/L K+和Cl-對葛仙米生理生化特性的影響較小。

李運廣等的研究結果表明，高于400 mmol/L NaCl對葛仙米產生較強的鹽脅迫，葛仙米的可溶性糖含量隨NaCl濃度的升高而降低。高濃度的鹽主要是通過降低細胞外的離子平衡，從而引起膜結構、細胞器及酶結構的破壞[8]。但本研究中，KCl和NH4Cl的濃度只有1 mmol/L，不足以對葛仙米產生強烈的鹽脅迫傷害。因此，1 mmol/L KCl對葛仙米的各項生理指標沒有顯著影響。但1 mmol/L NH4Cl對葛仙米生理生化特性的影響強烈，因此，NH4+對葛仙米的影響機制不同于鹽脅迫。陳珍等研究表明，NH4+破壞了葛仙米光系統Ⅱ的放氧復合體[7-9]。

在本研究中，1 mmol/L NH4Cl引起葛仙米細胞內丙二醛含量顯著升高。在逆境脅迫條件下，植物體細胞內活性氧自由基的代謝平衡被破壞，促進植物體內自由基大量產生，導致膜脂過氧化而生成丙二醛，影響細胞膜的正常結構與功能[12]。MDA含量通常被用作膜脂過氧化程度的指標[12]。脂膜過氧化還能影響植物光合作用和呼吸作用電子傳遞，從而導致活性氧自由基大量產生，進一步引起膜脂過氧化[13]。

因此，為了保護野生葛仙米資源的生態環境，筆者建議在葛仙米生長區水稻田的農業生產中，應該減少含氨氮的化學肥料的施用量。