96份桑樹地方品種農藝性狀的關聯分析

張 林， 高 敏， 倪紅梅， 方榮俊， 潘 剛， 趙衛國， 劉 利

(1.江蘇科技大學生物技術學院，江蘇鎮江 212018； 2.中國農業科學院蠶業研究所，江蘇鎮江 212018)

桑樹(MorusalbaL.)為桑科(Moraceae)桑屬(MorusL.)落葉喬木或灌木，原產中國中部和北部，葉為桑蠶飼料，桑樹品種、桑葉產量及葉質是養蠶的決定性因素。因此作為蠶業生產基礎資料的桑樹品種，其經濟性狀的改良對促進蠶業發展有著巨大的作用。不斷提高桑樹品種的產量、品質、抗病性和適應性是現代桑樹育種家追求的主要目標[1]。但是桑樹的多數經濟性狀與農藝性狀，例如產量、品質、抗逆性、抗病性等都是數量性狀。與質量性狀的遺傳特性不同，數量性狀受多基因的數量性狀位點控制，遺傳基礎比較復雜，而且容易被環境因素影響，且呈連續性變異，表現型與基因型的對應關系也不明確，對其遺傳基礎的研究比較困難[2]，了解和研究這些數量性狀的遺傳規律對農作物的遺傳改良具有重要意義。

本研究擬采用以PCR技術為基礎的ISSR技術探討供試材料的遺傳多樣性。ISSR技術具有遺傳多態性高、重復性好、使用范圍廣、操作簡單、試驗成本低等優點，ISSR技術因其簡便快速、穩定可靠的特性已在一些農作物和經濟作物的遺傳性研究上獲得了廣泛的應用并取得了理想的結果，該技術在研究桑樹種質資源的品種鑒定和親緣關系分析、群體遺傳結構和遺傳多樣性研究方面也是一種行之有效的工具。Prevost等采用4個ISSR引物對34個馬鈴薯品種進行分析研究，并將這34個品種區別開來[3]。Vijayan等用17個ISSR引物對印度桑屬野生品種進行了遺傳多樣性分析[4]。

關聯分析是建立在連鎖不平衡的基礎上，能夠識別群體內目標性狀與候選基因或遺傳標記之間的關系，從而鑒定群體內目標性狀與遺傳標記或候選基因關系的分析方法[5]。該方法近期開始在植物數量性狀研究和植物育種中應用，其利用的是自然變異，不需要花費過多的時間和精力去構建作圖群體，可以廣泛地檢測遺傳變異，具有較高的分辨率[1]。本研究擬對我國桑樹地方品種及創新桑種質的性狀進行關聯分析，從而尋找與其表型相關的優異基因，從分子水平解釋桑樹表型性狀的遺傳變異規律，進而為桑樹數量性狀遺傳改良研究提供理論基礎，為桑樹雜交育種尋求新途徑。Thornsberry首次將關聯分析引入到植物復雜性狀研究中，發現了與玉米花期性狀呈顯著性相關的Dwarf8基因序列的多態性[6]，被廣泛應用于擬南芥[7]、水稻[8]和大豆[9]等作物中。總之，關聯分析將成為研究植物數量性狀的強有力工具，為更深刻地認識和了解植物數量性狀的遺傳規律及品種的遺傳改良提供了新的方法和途徑。本研究利用ISSR分子標記技術，對黃河流域魯桑、太湖流域湖桑2種類型共96份桑樹品種的21個農藝性狀進行調查研究，并利用10個ISSR標記的多態性對供試材料進行遺傳多樣性和群體結構分析，從而分析遺傳標記與表型性狀的相關性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為取自中國農業科學院蠶業研究所江蘇鎮江國家桑樹種質資源圃的96份桑樹種質，其中包括34份黃河下游魯桑桑樹種質和62份太湖流域湖桑桑樹種質，供試的96份桑樹試驗材料的來源見表1。

1.2 桑樹種質資源農藝性狀的鑒定

在國家種質江蘇鎮江桑樹圃對桑樹種質農藝性狀進行田間調查，依據《桑樹種質資源描述規范和數據標準》[10]的要求確定取樣方法和調查標準，參照本課題組桑樹農藝性狀的數據庫，計算出每份桑樹種質資源的所有農藝性狀的平均值、變異系數和標準差，并進行方差檢驗分析，判斷試驗結果的可靠性和穩定性。取平均值作為該種質的最終性狀值，最后統計并分析各個性狀的平均值。

表1 桑樹種質資源材料的來源

續表1

編號品種來源桑種55甩桑2號浙江省新昌縣湖桑56胡桃桑浙江省肖山縣湖桑57彎條桑浙江省湖州市湖桑58湖桑3號江蘇省無錫市湖桑59湖桑5號浙江省杭州市湖桑60湖桑6號浙江省杭州市湖桑61湖桑10號江蘇省無錫市湖桑62湖桑20號江蘇省無錫市湖桑63湖桑21號江蘇省無錫市湖桑64湖桑24號江蘇省無錫市湖桑65湖桑26號江蘇省無錫市湖桑66湖桑31號江蘇省無錫市湖桑67溧陽紅皮江蘇省南京市湖桑68新橋青桑浙江省富陽市湖桑69湖桑36號江蘇省無錫市湖桑70湖桑37號江蘇省無錫市湖桑71湖桑38號江蘇省無錫市湖桑72湖桑39號江蘇省無錫市湖桑73湖實雞冠江蘇省無錫市湖桑74梅村1號江蘇省無錫市湖桑75湖桑60號江蘇省無錫市湖桑76無錫短節湖江蘇省無錫市湖桑77湖桑86號浙江省杭州市湖桑78鎮荷桑浙江省湖州市湖桑79洞庭1號江蘇省蘇州市湖桑80富陽青浙江省富陽市湖桑81富陽桑浙江省富陽市湖桑82石門青浙江省桐鄉市湖桑83早青桑浙江省德清縣湖桑84璜桑3號浙江省諸暨市湖桑85璜桑14號浙江省諸暨市湖桑86海鹽面青浙江省海鹽縣湖桑87大種桑浙江省富陽市湖桑88海桑浙江省鄞縣 湖桑89白色青浙江省海寧市湖桑90望海桑浙江省嵊縣 湖桑91菱湖大種浙江省湖州市湖桑92璜桑8號浙江省諸暨市湖桑93白皮大種浙江省湖州市湖桑94豬肚桑浙江省嵊縣 湖桑95吳興大種浙江省湖州市湖桑96剪刀桑浙江省嵊縣 湖桑

1.3 ISSR引物的選取與擴增

選取加拿大哥倫比亞大學的設計并參考趙衛國博士論文中部分引物[11]進行多態性篩選，初步選定了22個引物用于ISSR分子標記，引物由上海生物工程技術有限公司合成。桑樹總DNA的提取擬采用植物基因組提取試劑盒法，PCR程序為94 ℃ 7 min；94 ℃ 40 s，退火45s(根據Tm值而定)，72 ℃ 90 s，36個循環；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。ISSR-PCR電泳并照相記錄后，進行人工讀帶。同一引物的擴增產物中，分子量大小及強度相近的條帶被認為具同源性，屬于同一位點的產物。讀帶時要遵循排除模糊不清的條帶、只記錄清晰且易于辨認的條帶的原則。對于分子量大小相同但強度不同的條帶，當強帶的強度大于弱帶的2倍時，則將它們讀為不同的條帶。

1.4 群體結構分析

利用Structure 2.3.4軟件對供試材料進行基于貝葉斯數學模型的聚類分析，從而估算其群體結構關系。計算材料相應的遺傳成分系數(Q)：當某材料在某個類群中的Q值≥0.5時，該品種將被劃分到相應的類群中，認為該品種的血緣相對比較單一；若某材料在任何類群中的Q值均 <0.5 時，則認為該品種擁有混合來源[12-15]。按照以上方法將群體中各材料劃分至對應的亞群并繪制群體結構圖。

1.5 親緣關系系數分析

親緣關系系數(Kinship)是衡量品種間親緣相似性的參數，本研究采用SPAGeDi軟件計算96份桑樹種質個體間的親緣關系，得到親緣關系系數矩陣(K矩陣)。親緣關系是2個材料個體間的遺傳相似度與任意材料個體間遺傳相似度的相對值，因此當Kinship值<0時，表明某2個材料品種間的親緣關系低于群體中任意2個材料品種的親緣關系，則直接定義此值為0，所有系數加倍[16-17]。

1.6 標記和農藝性狀的關聯分析

結合TASSEL 2.1軟件中的MLM模型[17]，分析性狀與標記位點之間的關聯性，并計算標記位點對表型變異的貢獻率(即解釋率)。綜合96份桑樹材料各農藝性狀的表型數據和標記位點的多態性數據，以群體結構的Q值作為協變量，將96份供試材料的親緣關系K矩陣連同21個農藝性狀表型數據，對93個多態性標記位點進行標記和性狀間的關聯分析[17]。所得結果中當P<0.01時，則認為該標記與相應性狀之間存在極顯著的關聯性。

2 結果與分析

2.1 桑樹地方品種的主要農藝性狀

從表2可見，這21個農藝性狀變異幅度存在較大差異，其中變異系數在30%以上的性狀為生長芽率、春米條葉、秋公斤數、梢梗葉、椹梗葉、葉梗葉和株產葉量，梢梗葉、椹梗葉和葉梗葉的變異系數甚至達到了50%以上。椹梗葉的變異系數最大，為 180.99%，秋萬頭繭量的變異系數最小，為9.32%。結果表明，供試桑樹種質資源品種間的各性狀存在較大差異，多樣性比較豐富，可為桑樹育種提供豐富的親本材料。

表2 96份供試材料21個農藝性狀的基本描述性統計

2.2 遺傳多樣性統計分析與聚類分析

通過篩選，從22個引物中選出的多態性強、條帶清晰、結果穩定且重復性好的10個引物被用于桑樹地方品種的ISSR分子標記多態性分析。10個ISSR引物通過PCR反應共擴增出93條清晰的帶，其中73條帶具有多態性，多態性條帶百分率為78.49%，平均每個引物擴增的條帶數為9.3條，平均每個引物擴增的多態性條帶數為7.3條。不同引物的擴增帶數從7到11不等。平均每個位點觀測等位基因數為1.795 7，有效等位基因數為1.496 4，Nei’s遺傳多樣性指數為 0.286 9，Shannon’s信息指數為0.426 8，表明96份供試材料之間的ISSR變異大，多態性高。

2.3 品種聚類分析

利用73個多態性位點數據，96個品種被聚為2類(圖1)，Ⅰ類34份材料均為魯桑品種，來自山東省的7個品種親緣關系較近，被聚為一類，Ⅱ類為62份湖桑品種，湖桑和魯桑親緣關系較遠。

2.4 群體結構分析

通過采用基于貝葉斯的聚類分析方法分析供試材料的遺傳結構，從而確定其群體數目。利用Structure 2.3.4軟件評估群體的K值，即亞群數(范圍設為2～10)，依據運算的輸出結果，K與ΔK的關系如圖2所示。當K=2時，模型中的ΔK出現峰值。因此根據分析結果可將參試的96份桑樹種質劃分為2個亞群，群體結構聚類結果見圖3。各個品種在不同亞群中的Q值如表3所示，當Q<0.5時，亞群1含有的34份桑樹材料全部為黃河下游魯桑桑樹種質，亞群2的62份供試材料為太湖流域湖桑桑樹種質。96份樣本的劃分與UPGMA聚類分析的結果完全一致，這也體現了Structure軟件對群體結構進行聚類分析的準確性。

2.5 群體親緣關系分析

結合93個ISSR標記位點，利用SPAGeDi軟件對96份供試材料進行親緣關系分析，品種間的平均親緣關系Kinship值為0.111 3，其中52.11%的材料間的Kinship值為0，約39.63%的材料Kinship值在0～0.2之間，Kinship值小于0.5的情況達到了總數的96.18%，親緣關系在0.5以上的情況只占到了3.82%(圖4)。這說明96份地方桑樹品種間的親緣關系較弱，極少數的品種之間有較近的親緣關系，表明參試品種之間存在著豐富的遺傳變異和廣泛的代表性。

表3 96份桑樹材料在2個亞群中的Q值

2.6 標記與農藝性狀的關聯分析

通過TASSEL 2.1軟件的MLM模型，把Structure軟件計算出的群體結構數據(Q值)作為協變量，將96份供試材料的親緣關系K矩陣連同葉長、葉幅、節間距等農藝性狀表型數據對93個多態性標記位點進行標記和性狀間的關聯分析。標記位點對表型性狀的解釋率見表4。從表4可以看出，經MLM混合線性模型檢測的93個位點中，與15個表型農藝性狀(葉長、節間長、生長芽率、春米條葉、秋米條葉、春公斤數、秋公斤數、葉梗葉、梢梗葉、條梗葉、株產葉量、春萬頭繭量、春萬繭層量、春擔桑繭量、秋萬頭繭量)相關的標記位點共有28個，變異解釋率為5.42%～16.35%。其中與葉長相關的位點有2個，表型變異的解釋率為11.58%和8.62%，解釋率最大的標記為loci5。與節間長、生長芽率和秋萬頭繭量相關聯的位點各有3個，表型變異解釋率最大的標記分別位于loci86(解釋率為10.87%)、loci72(解釋率為8.62%)和loci45(解釋率為10.20%)。與春米條葉、春萬頭繭量、春擔桑繭量相關聯的位點各有5個，各自的表型變異解釋率分別在7.73%～10.69%、6.41%～13.73%、6.00%～11.97%之間，解釋率最大的標記分別為loci66、loci21和loci45。有2個標記位點與秋米條葉相關聯，位點loci66的表型變異解釋率最大，為15.40%。春公斤數、條梗葉和株產葉量都有4個標記位點與之相關聯，其中春公斤數的最大表型變異解釋率為loci70(解釋率為16.35%)，條梗葉和株產葉量都與loci64位點相關聯且二者的最大表型變異解釋率的標記也為loci64。秋公斤數只有變異解釋率為9.17%的loci81位點與之相關聯，葉梗葉與6個標記位點相關聯，最大變異解釋率為9.78%，位于loci59位點。與梢梗葉和春萬繭層量相關聯的標記位點各有7個，最大變異解釋率分別為13.92%和15.25%，位于位點loci90和位點loci21處。葉幅、發芽率等6個農藝性狀未檢測出與其相關聯的標記位點。在28個標記位點中有1個標記位點同時與5個農藝性狀相關聯，有4個位點同時與4個農藝性狀相關聯，有4個標記位點同時與3個農藝性狀相關聯，有10個位點同時與2個農藝性狀相關聯。

表4 與農藝性狀極顯著關聯(P<0.01)的標記位點及其對表型變異的解釋率

3 結論與討論

3.1 遺傳多樣性與群體結構分析

本研究通過利用ISSR分子標記對96份桑樹種質資源進行遺傳多樣性和群體結構分析，結果表明96份供試材料個體間存在著豐富的遺傳多樣性，同時基于遺傳系數的UPGMA聚類分析結果也顯示出了參試品種的遺傳多樣性。

在進行關聯分析時，一些本不關聯的等位基因會與一些目標性狀之間存在著連鎖不平衡(linkae disequilibrium，LD)現象，即所謂的偽關聯或假 陽性現象。因此在進行關聯分析時必須評估群體結構，了解群體內供試材料的遺傳學相關信息，這樣才能盡量減少假陽性現象的出現，以保證關聯分析準確有效地進行。利用Structure軟件對供試材料進行基于貝葉斯數學模型的群體結構聚類分析，結果顯示96份樣本的劃分與UPGMA聚類分析的結果完全一致，更準確地反映出了供試材料間的群體結構。

3.2 表型農藝性狀與分子標記的關聯分析

關聯分析作為一種數量性狀分析方法，已在植物研究領域得到廣泛應用。為減少關聯分析過程中存在的假陽性現象，本研究采用MLM模型對96份供試材料進行混合線性分析，該模型能有效檢測出多態性標記位點與性狀之間的關聯性，使關聯分析的結果更精確。分析結果顯示參試的10個ISSR標記共93個多態性位點中，在P<0.01的極顯著情況下，與葉長、節間距等15個農藝性狀相關的標記位點共有28個，變異解釋率為5.42%～16.35%，其中有1個標記位點同時與5個農藝性狀相關聯，有4個位點同時與4個農藝性狀相關聯，有4個標記位點同時與3個農藝性狀相關聯，有10個位點同時與2個農藝性狀相關聯，未檢測出與葉幅、發芽率等6個農藝性狀相關聯的標記位點。